1. प्रारंभिक समज

या टप्प्यावर, आपल्याला काही संकल्पना आणि शब्दावली समजून घेणे आवश्यक आहे, जेणेकरून आपल्या वरिष्ठांसमोर चुका होऊ नयेत, जसे की:

प्रश्न: आरटी-पीसीआर, क्यूपीसीआर, रिअल-टाइम पीसीआर आणि रिअल-टाइम आरटी-पीसीआरमध्ये काय फरक आहे?

उत्तर: आरटी-पीसीआर हे रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन पीसीआर आहे(रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन पीसीआर, आरटी-पीसीआर), जे पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शन (पीसीआर) चे मोठ्या प्रमाणावर वापरले जाणारे प्रकार आहे.RT-PCR मध्ये, RNA स्ट्रँडला पूरक DNA मध्ये उलट लिप्यंतरण केले जाते, जे नंतर PCR द्वारे DNA प्रवर्धनासाठी टेम्पलेट म्हणून वापरले जाते.
रिअल-टाइम-पीसीआर आणि क्यूपीसीआर(Quantitative Rea-ltime-PCR) एकच गोष्ट आहे, दोन्ही रिअल-टाइम परिमाणवाचक PCR आहेत, याचा अर्थ असा की PCR च्या प्रत्येक चक्रात रीअल-टाइम डेटा रेकॉर्ड आहे, त्यामुळे प्रारंभिक टेम्पलेट्सची संख्या अचूक विश्लेषण समायोजित केली जाऊ शकते.

जरी रिअल-टाइम पीसीआर (रिअल-टाइम फ्लोरोसेंट क्वांटिटेटिव्ह पीसीआर) आणि रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन पीसीआर (रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन पीसीआर) हे आरटी-पीसीआर म्हणून संक्षिप्त असल्याचे दिसत असले तरी, आंतरराष्ट्रीय नियम असा आहे: आरटी-पीसीआर विशेषत: रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनचा संदर्भ देते.पीसीआर, रिअल-टाइम पीसीआर सामान्यतः क्यूपीसीआर (परिमाणात्मक रिअल-टाइम पीसीआर) म्हणून संक्षिप्त केले जाते..

आणि रिअल-टाइम RT-PCR (RT-qPCR), हे फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक तंत्रज्ञानासह एकत्रित केलेले रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन पीसीआर आहे: प्रथम RNA रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन वरून cDNA (RT) मिळवा आणि नंतर परिमाणात्मक विश्लेषणासाठी (qPCR) रिअल-टाइम पीसीआर वापरा.बहुतेक प्रयोगशाळा आरटी-क्यूपीसीआर करतात, म्हणजेच आरएनए एक्स्प्रेशन डाउन-रेग्युलेशनवर संशोधन करतात, त्यामुळे प्रयोगशाळेत प्रत्येकजण ज्या क्यूपीसीआरबद्दल बोलतो तो प्रत्यक्षात आरटी-क्यूपीसीआरचा संदर्भ देतो, परंतु क्लिनिकल अॅप्लिकेशन्समध्ये अजूनही अनेक डीएनए चाचण्या आहेत हे विसरू नका.परिमाणात्मक विश्लेषण, जसे की हिपॅटायटीस बी व्हायरस एचबीव्ही शोध.

प्रश्न: भरपूर फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक पीसीआर वाचल्यानंतर, प्रवर्धित तुकडा 80-300bp च्या मर्यादेत का नियंत्रित केला जावा?

उत्तर द्या: प्रत्येक जनुक क्रमाची लांबी भिन्न असते, काही अनेक kb असतात, काही शेकडो bp असतात, परंतु आम्हाला प्राइमर्स डिझाइन करताना उत्पादनाची लांबी फक्त 80-300bp असणे आवश्यक असते, खूप लहान किंवा खूप लांब हे फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक PCR शोधण्यासाठी योग्य नसतात.उत्पादनाचा तुकडा प्राइमर-डायमरपासून वेगळे करणे खूप लहान आहे.प्राइमर-डायमरची लांबी सुमारे 30-40bp आहे आणि 80bp पेक्षा कमी असल्यास ते प्राइमर-डायमर आहे की उत्पादन आहे हे ओळखणे कठीण आहे.जर उत्पादनाचा तुकडा खूप लांब असेल, 300bp पेक्षा जास्त असेल, तर ते सहजपणे कमी प्रवर्धन कार्यक्षमतेकडे नेईल आणि जनुकाचे प्रमाण प्रभावीपणे शोधू शकत नाही.

उदाहरणार्थ, जेव्हा तुम्ही वर्गात किती लोक आहेत हे मोजता तेव्हा तुम्हाला फक्त किती तोंडे आहेत हे मोजावे लागते.जेव्हा तुम्ही जीन्स शोधता तेव्हा तेच खरे असते, तुम्हाला फक्त जनुकाचा एक विशिष्ट क्रम शोधणे आवश्यक आहे जे संपूर्ण अनुक्रम करेल.जर तुम्हाला लोकांची गणना करायची असेल तर तुम्हाला तोंड आणि नाक, कान आणि चष्मा दोन्ही मोजणे आवश्यक आहे आणि चुका करणे सोपे आहे.

विस्तारित करण्यासाठी, जैविक संशोधनामध्ये, बिंदूपासून क्षेत्रापर्यंत अनेक संशोधन प्रकरणे आहेत, कारण कोणत्याही प्रजातीचा जनुकांचा क्रम खूप लांब असतो, सर्व तुकड्यांचे मोजमाप करणे अनावश्यक आणि अशक्य आहे, जसे की बॅक्टेरिया 16S अनुक्रम, जो जीवाणूंचा पुराणमतवादी क्रम पार पाडण्यासाठी आहे.

प्रश्न: qPCR प्राइमर डिझाइनसाठी इष्टतम लांबी किती आहे?

उत्तर द्या: सर्वसाधारणपणे, प्राइमरची लांबी सुमारे 20-24bp असते, जे अधिक चांगले आहे.अर्थात, प्राइमरची रचना करताना आपण प्राइमरच्या टीएम मूल्याकडे लक्ष दिले पाहिजे, कारण हे इष्टतम अॅनिलिंग तापमानाशी संबंधित आहे.बर्‍याच प्रयोगांनंतर, हे सिद्ध झाले आहे की 60 डिग्री सेल्सिअस हे चांगले टीएम मूल्य आहे.एनीलिंग तापमान खूप कमी असल्यास, ते सहजपणे विशिष्ट नसलेल्या प्रवर्धनाकडे नेईल.जर एनीलिंग तापमान खूप जास्त असेल तर, प्रवर्धन कार्यक्षमता तुलनेने कमी असेल, प्रवर्धन वक्रचा शिखर नंतर सुरू होईल आणि सीटी मूल्य विलंबित होईल.

प्रश्न: डाई पद्धत प्रोब पद्धतीपेक्षा वेगळी कशी आहे?

उत्तर: डाई पद्धतकाही फ्लोरोसेंट रंग, जसे की SYBR ग्रीन Ⅰ, पिकोग्रीन, BEBO, इ., स्वतःहून प्रकाश उत्सर्जित करत नाहीत, परंतु दुहेरी-असरलेल्या DNA च्या किरकोळ खोबणीला बांधल्यानंतर ते प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करतात.म्हणून, पीसीआर प्रतिक्रियेच्या सुरूवातीस, मशीन फ्लोरोसेंट सिग्नल शोधू शकत नाही.जेव्हा प्रतिक्रिया अॅनिलिंग-विस्ताराच्या टप्प्यावर पोहोचते, तेव्हा दुहेरी स्ट्रँड उघडला जातो आणि डीएनए पॉलिमरेझच्या क्रियेखाली एक नवीन स्ट्रँड संश्लेषित केला जातो आणि फ्लोरोसेंट रेणू dsDNA किरकोळ खोबणीला बांधला जातो.पीसीआर चक्रांची संख्या जसजशी वाढत जाते, तसतसे अधिकाधिक रंग दुहेरी-असरलेल्या डीएनएसह एकत्र केले जातात आणि फ्लोरोसेंट सिग्नल देखील सतत वर्धित केले जातात.डाई पद्धत प्रामुख्याने वैज्ञानिक संशोधनात वापरली जाते.
ता.क.: प्रयोग करताना सावधगिरी बाळगा, रंग मानवी डीएनएशी जोडला जाणे आवश्यक आहे, ते फ्लोरोसेंट व्यक्तीमध्ये बदलण्याची काळजी घ्या.

डाई पद्धत (डावीकडे) प्रोब पद्धत (उजवीकडे)
ता.क.: प्रयोग करताना सावधगिरी बाळगा, रंग मानवी डीएनएशी जोडला जाणे आवश्यक आहे, ते फ्लोरोसेंट व्यक्तीमध्ये बदलण्याची काळजी घ्या.

SYBR हिरवा Ⅰ DNA च्या लहान खोबणीला जोडतो

तपासणी पद्धतताकमान प्रोब हा सर्वात जास्त वापरला जाणारा हायड्रोलिसिस प्रोब आहे.प्रोबच्या 5′ शेवटी एक फ्लोरोसेंट गट असतो, सामान्यतः FAM, आणि प्रोब स्वतः लक्ष्य जनुकाला पूरक असा क्रम असतो.3′ टोकाला फ्लोरोसेंट शमन गट आहे.फ्लूरोसेन्स रेझोनान्स एनर्जी ट्रान्सफर (Förster रेझोनान्स एनर्जी ट्रान्सफर, FRET) च्या तत्त्वानुसार, जेव्हा रिपोर्टर फ्लोरोसेंट ग्रुप (दाता फ्लूरोसंट रेणू) आणि क्वेंचिंग फ्लूरोसंट ग्रुप (स्वीकारणारा फ्लोरोसेंट रेणू) उत्साहित असतात तेव्हा स्पेक्ट्रा ओव्हरलॅप होतो आणि अंतर 100 मीटर (एक्सटेंट) मध्ये खूप जवळ येऊ शकते. स्वीकारकर्ता रेणूचा फ्लूरोसेन्स, तर ऑटोफ्लोरेसेन्स कमकुवत झाला आहे.म्हणून, पीसीआर प्रतिक्रियेच्या सुरूवातीस, जेव्हा सिस्टममध्ये प्रोब मुक्त आणि अखंड असेल, तेव्हा रिपोर्टर फ्लोरोसेंट ग्रुप फ्लूरोसेन्स उत्सर्जित करणार नाही.एनीलिंग करताना, प्राइमर आणि प्रोब टेम्पलेटशी बांधले जातात.विस्ताराच्या अवस्थेत, पॉलिमरेज सतत नवीन साखळ्यांचे संश्लेषण करते.DNA पॉलिमरेझमध्ये 5′-3′ exonuclease क्रियाकलाप आहे.प्रोबपर्यंत पोहोचताना, डीएनए पॉलिमरेज टेम्प्लेटमधून प्रोबचे हायड्रोलायझ करेल, रिपोर्टर फ्लोरोसेंट ग्रुपला क्वेन्चर फ्लूरोसंट ग्रुपपासून वेगळे करेल आणि फ्लोरोसेंट सिग्नल सोडेल.प्रोब आणि टेम्प्लेट यांच्यात एक-एक संबंध असल्याने, चाचणीची अचूकता आणि संवेदनशीलतेच्या बाबतीत प्रोब पद्धत डाई पद्धतीपेक्षा श्रेष्ठ आहे.तपासणी पद्धत प्रामुख्याने निदानासाठी वापरली जाते.

प्रश्न: परिपूर्ण परिमाण म्हणजे काय?सापेक्ष परिमाण म्हणजे काय?

उत्तर द्या: संपूर्ण प्रमाणीकरण म्हणजे qPCR द्वारे तपासल्या जाणार्‍या नमुन्याच्या प्रारंभिक प्रत क्रमांकाची गणना, जसे की रक्ताच्या 1ml मध्ये किती HBV विषाणू आहेत.सापेक्ष परिमाणीकरणाद्वारे प्राप्त झालेला परिणाम म्हणजे विशिष्ट नमुन्यातील लक्ष्य जनुकाच्या प्रमाणात दुसर्‍या संदर्भ नमुन्याशी संबंधित बदल आणि जनुक अभिव्यक्ती अप-रेग्युलेट किंवा डाउन-रेग्युलेट असते.

प्रश्न: आरएनए काढण्याचे प्रमाण, उलट प्रतिलेखन कार्यक्षमता आणि प्रवर्धन कार्यक्षमता प्रायोगिक परिणामांवर परिणाम करेल?
प्रश्न: सॅम्पल स्टोरेज, एक्सट्रॅक्शन अभिकर्मक, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन अभिकर्मक आणि प्रकाश-प्रेषण उपभोग्य वस्तू प्रायोगिक परिणामांवर परिणाम करतील का?
प्रश्न: प्रायोगिक डेटा कोणती पद्धत दुरुस्त करू शकते?

या समस्यांबद्दल, आम्ही खाली प्रगत आणि प्रगत विभागांमध्ये त्यांचे तपशीलवार वर्णन करू.
2. प्रगत ज्ञान

रिअल-टाइम फ्लोरोसेंट परिमाणवाचक पीसीआरच्या संदर्भात, आम्ही हे वास्तव ओळखले पाहिजे की दरवर्षी हजारो वैज्ञानिक शोधनिबंध प्रकाशित केले जातात, त्यापैकी फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक पीसीआर तंत्रज्ञान कमी नाही.

फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक PCR प्रयोग मोजण्यासाठी कोणतेही सामान्य मानक नसल्यास, परिणाम मोठ्या प्रमाणात बदलू शकतात.एकाच प्रजातीच्या समान जनुकांसाठी, समान प्रक्रिया पद्धतीसह, शोध परिणाम देखील मोठ्या प्रमाणात बदलतील आणि उशीरा येणाऱ्यांसाठी समान परिणामांची पुनरावृत्ती करणे कठीण होईल.तुम्हाला कोणते बरोबर आणि कोणते अयोग्य हे कोणालाच माहीत नाही.

याचा अर्थ फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक पीसीआर हे फसवणूक तंत्रज्ञान आहे की अविश्वसनीय तंत्रज्ञान आहे?नाही, याचे कारण असे आहे की फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक पीसीआर अधिक संवेदनशील आणि अधिक अचूक आहे आणि थोडेसे चुकीचे ऑपरेशन पूर्णपणे उलट परिणाम देईल.एक लहान नुकसान हजार मैल दूर आहे.लेखाच्या लेखकाला समीक्षकांकडून वारंवार छळ होऊ शकतो.त्याच वेळी, जर्नलच्या पुनरावलोकनकर्त्यांना वेगवेगळ्या प्रायोगिक परिणामांमधून निवडणे देखील कठीण आहे.

एकूणच, रिअल-टाइम पीसीआर प्रयोगांमध्ये एकमताच्या अभावाकडे लक्ष वेधले.यासाठी उद्योगातील वरिष्ठ शास्त्रज्ञांनी मानके तयार करण्यास सुरुवात केली,या मानकांची पूर्तता करण्यासाठी योगदानकर्त्यांना लेखातील काही आवश्यक प्रायोगिक आणि डेटा प्रक्रिया तपशील (आवश्यक डेटासह) प्रदान करणे आवश्यक आहे.

हे तपशील वाचून समीक्षक प्रयोगाच्या गुणवत्तेचा न्याय करू शकतात;भविष्यातील वाचक प्रयोगाची पुनरावृत्ती करण्यासाठी किंवा प्रयोग सुधारण्यासाठी देखील याचा वापर करू शकतात.मग अशा प्रकारे प्राप्त झालेले प्रायोगिक परिणाम माहितीने परिपूर्ण, उच्च दर्जाचे आणि वापरण्यायोग्य असतात.

MIBBI (जैविक आणि जैववैद्यकीय तपासणीसाठी किमान माहिती -http://www.mibbi.org) अस्तित्वात आले.MIBBI हा एक प्रकल्प आहे जो प्रयोगांसाठी मानके प्रदान करतो.हे निसर्गात प्रकाशित झाले आहे.या प्रकल्पाचा उद्देश सेल बायोलॉजी, मायक्रोएरे, क्यूपीसीआर यासह विविध जैविक प्रयोगांसाठी आहे, ज्याची आपण आता चर्चा करणार आहोत, इ. आणि हस्तलिखिते सबमिट करताना प्रत्येक प्रकारच्या प्रयोगाची तरतूद करतो.ती माहिती नेहमीच दिली जावी.

MIBBI प्रकल्पामध्ये, फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक पीसीआरशी संबंधित दोन लेख आहेत, म्हणजे:
·आरडीएमएल (रिअल-टाइम पीसीआर डेटा मार्कअप लँग्वेज) – रीअल-टाइम परिमाणात्मक पीसीआर डेटासाठी एक संरचित भाषा आणि अहवाल मार्गदर्शक;
· MIQE (परिमाणात्मक रिअल-टाइम पीसीआर प्रयोगांच्या प्रकाशनासाठी किमान माहिती) – रिअल-टाइम परिमाणात्मक पीसीआर प्रयोगांबद्दल लेख प्रकाशित करण्यासाठी किमान माहिती.
प्रथम, RDML बद्दल बोलूया, शब्दावली तपशील.

प्रत्येक गोष्टीसाठी मानक व्याख्या नसल्यास, चर्चा चालू ठेवणे अशक्य आहे, म्हणूनच परीक्षेत अटींचे स्पष्टीकरण इतके महत्त्वाचे आहे.
फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक पीसीआर प्रयोगात वापरल्या जाणार्‍या शब्दावलीमध्ये खालील सामग्री समाविष्ट आहे.QIAGEN ने आमच्यासाठी सर्वोत्तम सारांश तयार केला आहे.खालील सर्व कोरडे आहेतमाल .

प्रवर्धन वक्र
अॅम्प्लीफिकेशन वक्र PCR प्रक्रियेदरम्यान बनवलेल्या वक्रला संदर्भित करते, ज्यामध्ये चक्र क्रमांक abscissa आणि रिअल-टाइम फ्लूरोसेन्स तीव्रता ऑर्डिनेट म्हणून प्रतिक्रियेदरम्यान असतो.

उत्कृष्ट प्रवर्धन वक्रमध्ये खालील वैशिष्ट्ये असावीत: आधाररेखा सपाट आहे किंवा किंचित कमी झाली आहे, आणि कोणताही स्पष्ट वरचा कल नाही;वक्राचा विक्षेपण बिंदू स्पष्ट आहे, आणि घातांक टप्प्याचा उतार प्रवर्धन कार्यक्षमतेच्या प्रमाणात आहे.उतार जितका जास्त असेल तितकी प्रवर्धन कार्यक्षमता जास्त असेल;एकूण प्रवर्धन वक्र समांतरता चांगली आहे, हे दर्शविते की प्रत्येक ट्यूबची प्रवर्धन कार्यक्षमता समान आहे;कमी एकाग्रतेच्या नमुन्यांच्या प्रवर्धन वक्रचा घातांकीय टप्पा स्पष्ट आहे.

बेसलाइन (बेसलाइन)
बेसलाइन ही सुरुवातीच्या चक्राची आवाज पातळी आहे, सामान्यतः 3 रा आणि 15 व्या चक्रादरम्यान मोजले जाते, कारण प्रवर्धन उत्पादनामुळे होणारी फ्लूरोसेन्स मूल्य वाढ या कालावधीत शोधली जाऊ शकत नाही.बेसलाइनची गणना करण्यासाठी वापरल्या जाणार्‍या चक्रांची संख्या भिन्न असू शकते आणि उच्च टेम्पलेट प्रमाण वापरल्यास किंवा लक्ष्य जनुकाची अभिव्यक्ती पातळी जास्त असल्यास कमी करणे आवश्यक आहे.

बेसलाइन सेट करण्यासाठी रेखीयता प्रवर्धन वक्र वरून फ्लूरोसेन्स डेटा पाहणे आवश्यक आहे.बेसलाइन सेट केली जाते जेणेकरून अॅम्प्लीफिकेशन वक्र वाढ बेसलाइन सायकल टॉप नंबरपेक्षा मोठ्या चक्र क्रमांकाने सुरू होते.प्रत्येक लक्ष्य क्रमासाठी बेसलाइन स्वतंत्रपणे सेट करणे आवश्यक आहे.सुरुवातीच्या चक्रांमध्ये आढळलेली सरासरी फ्लूरोसेन्स मूल्ये प्रवर्धित उत्पादनांमध्ये मिळवलेल्या प्रतिदीप्ति मूल्यांमधून वजा करणे आवश्यक आहे.विविध रिअल-टाइम पीसीआर सॉफ्टवेअरच्या नवीनतम आवृत्त्या वैयक्तिक नमुन्यांसाठी बेसलाइन सेटिंग्जचे स्वयंचलित ऑप्टिमायझेशन करण्यास अनुमती देतात.

पीसीआर अॅम्प्लीफिकेशन रिअॅक्शनच्या पहिल्या काही चक्रांमध्ये, फ्लूरोसेन्स सिग्नल फारसा बदलत नाही.सरळ रेषेच्या जवळ जाण्याला आधाररेषा म्हणतात, परंतु जर आपण पहिल्या काही चक्रांकडे बारकाईने पाहिले तर आपल्याला दिसेल की खालील चित्रात जे घडत आहे ते बेसलाइनमध्ये आहे.

पार्श्वभूमी पार्श्वभूमी संदर्भित करते
प्रतिक्रियेतील गैर-विशिष्ट प्रतिदीप्ति मूल्य.उदाहरणार्थ: अकार्यक्षम प्रतिदीप्ति शमन;किंवा SYBR ग्रीनच्या वापरामुळे मोठ्या संख्येने डबल-स्ट्रँडेड DNA टेम्पलेट्स.रिअल-टाइम पीसीआर सॉफ्टवेअर अल्गोरिदमद्वारे सिग्नलचे पार्श्वभूमी घटक गणिती पद्धतीने काढले जातात.

रिपोर्टर सिग्नल
रिपोर्टर सिग्नल रीअल-टाइम पीसीआर दरम्यान SYBR ग्रीन किंवा फ्लोरोसेंट लेबल केलेल्या अनुक्रम-विशिष्ट प्रोबद्वारे व्युत्पन्न केलेल्या फ्लोरोसेंट सिग्नलचा संदर्भ देते.

सामान्यीकृत रिपोर्टर सिग्नल (RN)
RN प्रत्येक चक्रात मोजल्या जाणार्‍या निष्क्रिय संदर्भ डाईच्या फ्लोरोसेन्स तीव्रतेने विभाजित केलेल्या रिपोर्टर डाईच्या फ्लोरोसेन्स तीव्रतेचा संदर्भ देते.

निष्क्रिय संदर्भ डाई
काही रिअल-टाइम पीसीआरमध्ये,फ्लोरोसेंट डाय रॉक्सचा वापर फ्लोरोसेंट सिग्नल सामान्य करण्यासाठी अंतर्गत संदर्भ म्हणून केला जातो.चुकीचे पाइपिंग, विहीर स्थिती आणि वेल-बाय-वेल आधारावर फ्लोरोसेन्स चढ-उतार यांमुळे हे फरक सुधारते.

फ्लोरोसेन्स थ्रेशोल्ड (थ्रेशोल्ड)
पार्श्वभूमी मूल्याच्या वर आणि प्रवर्धन वक्रच्या पठार मूल्याच्या लक्षणीय खाली समायोजित केले.हे प्रवर्धन वक्रच्या रेखीय प्रदेशात असले पाहिजे, PCR शोधण्याच्या लॉग-रेखीय श्रेणीचे प्रतिनिधित्व करते.थ्रेशोल्ड लॉग-एम्प्लीफिकेशन वक्र दृश्यामध्ये सेट केले जावे जेणेकरुन PCR चा लॉग-लाइनियर टप्पा सहज ओळखता येईल.रिअल-टाइम पीसीआरमध्ये एकाधिक लक्ष्य जीन्स असल्यास, प्रत्येक लक्ष्यासाठी थ्रेशोल्ड सेट करणे आवश्यक आहे.सामान्यतः, पीसीआर प्रतिक्रियेच्या पहिल्या 15 चक्रांचा फ्लूरोसेन्स सिग्नल फ्लूरोसेन्स पार्श्वभूमी सिग्नल म्हणून वापरला जातो आणि फ्लूरोसेन्स थ्रेशोल्ड पीसीआरच्या पहिल्या 3 ते 15 चक्रांच्या फ्लूरोसेन्स सिग्नलच्या मानक विचलनाच्या 10 पट आहे आणि फ्लूरोसेन्स थ्रेशोल्ड प्रीसीआर एम्पोनियल फेजमध्ये सेट केले जाते.सर्वसाधारणपणे, वापरण्यापूर्वी प्रत्येक इन्स्ट्रुमेंटचा फ्लोरोसेन्स थ्रेशोल्ड सेट केलेला असतो.

सायकल थ्रेशोल्ड (CT) किंवा क्रॉसिंग पॉइंट (CP)
ज्या चक्रावर प्रवर्धन वक्र थ्रेशोल्ड ओलांडतो (म्हणजे, ज्या बिंदूवर प्रतिदीप्ति शोध लक्षणीयरीत्या वाढते).CT हा अपूर्णांक असू शकतो आणि प्रारंभिक टेम्पलेटची रक्कम मोजली जाऊ शकते.प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया ट्यूबमधील फ्लोरोसेंट सिग्नल सेट थ्रेशोल्डवर पोहोचल्यावर CT मूल्य अनुभवलेल्या चक्रांची संख्या दर्शवते.प्रत्येक टेम्प्लेटचे CT मूल्य आणि टेम्प्लेटच्या प्रारंभिक प्रत क्रमांकाच्या लॉगरिथममध्ये एक रेषीय संबंध आहे,प्रारंभिक प्रत क्रमांक जास्त, CT मूल्य जितके लहान असेल आणि त्याउलट.ज्ञात प्रारंभिक प्रत क्रमांकासह मानक वापरून एक मानक वक्र तयार केला जाऊ शकतो, ज्यामध्ये abscissa CT मूल्य दर्शवते आणि ordinate प्रारंभिक कॉपी क्रमांकाचे लॉगरिथम दर्शवते.म्हणून, जोपर्यंत अज्ञात नमुन्याचे CT मूल्य प्राप्त होत आहे, तोपर्यंत नमुन्याचा प्रारंभिक प्रत क्रमांक मानक वक्र वरून काढला जाऊ शकतो.

ΔCT मूल्य
ΔCT मूल्य वर्णन करतेलक्ष्य जनुक आणि संबंधित अंतर्जात संदर्भ जनुक CT मूल्य यांच्यातील फरक, जसे की हाउसकीपिंग जीन, आणि वापरलेल्या टेम्पलेटचे प्रमाण सामान्य करण्यासाठी वापरले जाते:
⇒ΔCT = CT (लक्ष्य जनुक) - CT (अंतर्जात संदर्भ जनुक)

ΔΔCT मूल्य
ΔΔCT मूल्य स्वारस्याच्या नमुन्याचे सरासरी ΔΔCT मूल्य (उदा., उत्तेजित पेशी) आणि संदर्भ नमुन्याचे सरासरी ΔΔCT मूल्य (उदा., उत्तेजित पेशी) यांच्यातील फरकाचे वर्णन करते.संदर्भ नमुन्याला कॅलिब्रेशन नमुना असेही म्हणतात आणि इतर सर्व नमुने सापेक्ष परिमाणासाठी सामान्यीकृत केले जातात:
⇒ΔΔCT = सरासरी ΔCT (व्याजाचा नमुना) - सरासरी ΔCT (संदर्भ नमुना)

अंतर्जात संदर्भ जीन्स (अंतर्जात संदर्भ जीन्स)
अंतर्जात संदर्भ जनुकांची अभिव्यक्ती पातळी, जसे की हाउसकीपिंग जीन्स (हाउसकीपिंग जीन्स), नमुन्यांमध्ये भिन्न नाहीत.संदर्भ जनुकाच्या CT मूल्यांची लक्ष्य जनुकाशी तुलना केल्याने लक्ष्य जनुकाची अभिव्यक्ती पातळी इनपुट RNA किंवा cDNA च्या प्रमाणात सामान्य केली जाऊ शकते (वरील ΔCT मूल्यांवरील विभाग पहा).

साठी अंतर्गत संदर्भ जीन्स योग्यसंभाव्य RNA ऱ्हास किंवा RNA नमुन्यांमध्ये एन्झाइम इनहिबिटरची उपस्थिती, तसेच RNA सामग्रीतील फरक, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन कार्यक्षमता, न्यूक्लिक अॅसिड रिकव्हरी आणि नमुना हाताळणी.इष्टतम संदर्भ जनुक निवडण्यासाठी, प्रायोगिक सेटिंगवर अवलंबून असलेल्या इष्टतम संदर्भाची निवड करण्यास अनुमती देण्यासाठी आम्ही अल्गोरिदम सुधारित केले.

अंतर्गत नियंत्रण
एक नियंत्रण क्रम जो लक्ष्य अनुक्रमाप्रमाणेच प्रतिक्रियेमध्ये वाढविला जातो आणि वेगळ्या प्रोबसह तपासला जातो (म्हणजे डुप्लेक्स पीसीआर करत आहे).अंतर्गत नियंत्रणे अनेकदा अयशस्वी वाढ नाकारण्यासाठी वापरली जातात, जसे की जेव्हा लक्ष्य क्रम सापडत नाही.
कॅलिब्रेशन नमुना
जनुकाची सापेक्ष अभिव्यक्ती पातळी निर्धारित करण्यासाठी इतर सर्व नमुन्यांची तुलना करण्यासाठी सापेक्ष परिमाणात वापरलेला संदर्भ नमुना (उदाहरणार्थ, सेल लाइन किंवा टिश्यूमधून शुद्ध केलेला आरएनए).कॅलिब्रेशन नमुना कोणताही नमुना असू शकतो, परंतु तो सामान्यतः एक नियंत्रण असतो (उदाहरणार्थ, उपचार न केलेला नमुना किंवा प्रयोगाच्या शून्यातील नमुना).

सकारात्मक नियंत्रणे
सह नियंत्रण प्रतिक्रिया वापराटेम्पलेटचे ज्ञात प्रमाण.प्राइमर सेट किंवा प्राइमर-प्रोब सेट योग्यरित्या कार्य करत आहे आणि प्रतिक्रिया योग्यरित्या सेट केली आहे हे तपासण्यासाठी सकारात्मक नियंत्रणे सहसा वापरली जातात.

टेम्पलेट नियंत्रण नाही (NTC)
एक नियंत्रण प्रतिक्रिया ज्यामध्ये टेम्प्लेट वगळता प्रवर्धन प्रतिक्रियेचे सर्व आवश्यक घटक असतात, जे सहसा पाण्याने बदलले जाते.एनटीसीचा वापर अभिकर्मक दूषित किंवा परदेशी डीएनएमुळे होणारी दूषितता शोधू शकतो, अशा प्रकारे शोध डेटाची सत्यता आणि विश्वासार्हता सुनिश्चित करते.एनटीसी नियंत्रणाचे विस्तारीकरण दूषित होण्याचे संकेत देते.

आरटी कंट्रोल नाही (NRT)
RNA काढण्याच्या प्रक्रियेमध्ये अवशिष्ट जीनोमिक डीएनए असू शकतो, जो अत्यंत हानिकारक आहे आणि तो डेटा गुणवत्तेवर परिणाम करणारा दोषी आहे आणि qPCR चा नैसर्गिक शत्रू आहे, म्हणून प्रयोगांची रचना करताना, ते केवळ RNA शोध वाढवण्यासाठी डिझाइन केलेले असणे आवश्यक आहे.दोन मार्ग आहेत, एक म्हणजे इंट्रोन्सवर प्राइमर्स डिझाइन करणे, दुसरा DNA पूर्णपणे काढून टाकणे, कोणता चांगला आहे, ज्याची नंतर चर्चा केली जाईल.डीएनए प्रदूषण शोधण्यासाठी एनटीआर नियंत्रण हा जादूचा आरसा आहे.जर प्रवर्धन असेल तर याचा अर्थ प्रदूषण आहे.

मानके
मानके हे ज्ञात एकाग्रतेचे किंवा कॉपी क्रमांकाचे नमुने आहेत जे मानक वक्र तयार करण्यासाठी वापरले जातात.मानकाची स्थिरता सुनिश्चित करण्यासाठी, जनुकाचा तुकडा सामान्यतः प्लाझमिडमध्ये क्लोन केला जातो आणि मानक म्हणून वापरला जातो.

मानक वक्र
सामान्यतः दुप्पट गुणोत्तरानुसार प्रमाणित उत्पादनासह किमान 5 एकाग्रता ग्रेडियंटमध्ये पातळ केले जाते आणि CT मूल्य आणि कॉपी क्रमांकाच्या समन्वयामध्ये 5 बिंदू काढले जातात आणि बिंदू मानक वक्र तयार करण्यासाठी एक रेषा तयार करण्यासाठी जोडलेले असतात.प्रत्येक मानक वक्रसाठी, त्याची वैधता तपासणे आवश्यक आहे.उताराचे मूल्य –3.3 आणि –3.8 च्या दरम्यान येते आणि प्रत्येक एकाग्रता त्रिगुणांमध्ये केली जाते.इतर बिंदूंपेक्षा लक्षणीय भिन्न असलेले गुण टाकून द्यावेत.चाचणी करायच्या नमुन्याचे CT मूल्य मानक वक्र मध्ये आणले जाते आणि चाचणी करायच्या नमुन्याची अभिव्यक्ती पातळी मोजली जाऊ शकते.

चाचणी करायच्या नमुन्याचे CT मूल्य मानक वक्र मध्ये आणले जाते आणि चाचणी करायच्या नमुन्याची प्रारंभिक कॉपी संख्या मोजली जाऊ शकते.

कार्यक्षमता आणि उतार
मानक वक्रचा उतार रिअल-टाइम पीसीआरची कार्यक्षमता दर्शवतो.
· -3.322 चा उतार दर्शवितो की पीसीआर प्रवर्धन कार्यक्षमता 1, किंवा 100% कार्यक्षम आहे आणि प्रत्येक चक्रात पीसीआर उत्पादनाची मात्रा दुप्पट होते.
· –3.322 पेक्षा कमी उतार (उदा. –3.8) पीसीआर कार्यक्षमता दर्शवते
· –3.322 पेक्षा जास्त उतार (उदा. –3.0) PCR कार्यक्षमता 100% पेक्षा जास्त असल्याचे दर्शविते, जे उत्सुकतेचे आहे, PCR चे एक चक्र प्रवर्धित उत्पादनापेक्षा दुप्पट कसे निर्माण करू शकते?ही परिस्थिती पीसीआर प्रतिक्रियेच्या नॉन-रेखीय टप्प्यात उद्भवते, म्हणजेच, मोठ्या प्रमाणात गैर-विशिष्ट प्रवर्धन आहे.

वितळणारा वक्र
क्यूपीसीआर प्रवर्धन पूर्ण झाल्यानंतर, पीसीआर उत्पादन गरम केले जाते.जसजसे तापमान वाढते तसतसे दुहेरी-अडकलेले प्रवर्धन उत्पादन हळूहळू वितळते, परिणामी फ्लूरोसेन्स तीव्रता कमी होते.जेव्हा विशिष्ट तापमान (Tm) गाठले जाते, तेव्हा मोठ्या प्रमाणात उत्पादने वितळतात.फ्लोरोसेन्स झपाट्याने कमी होते.वेगवेगळ्या पीसीआर उत्पादनांमध्ये भिन्न टीएम मूल्ये आणि भिन्न वितळण्याचे तापमान असते, ज्यामुळे पीसीआरची विशिष्टता ओळखता येते.

वितळणारा वक्र (व्युत्पन्न वक्र)
पीक मॅप तयार करण्यासाठी वितळण्याची वक्र व्युत्पन्न केली जाते, जे PCR उत्पादनाच्या तुकड्यांची परिस्थिती अधिक अंतर्ज्ञानाने प्रदर्शित करू शकते.वितळण्याचे तापमान हे DNA तुकड्याचे Tm मूल्य असल्याने, DNA तुकड्याच्या Tm मूल्यावर परिणाम करणारे काही मापदंड ठरवले जाऊ शकतात, जसे की तुकड्यांचा आकार, GC सामग्री, इ. सामान्यपणे, आमच्या प्राइमर डिझाइन तत्त्वांनुसार,प्रवर्धित उत्पादनाची लांबी 80-300bp च्या श्रेणीत आहे, म्हणून वितळण्याचे तापमान 80°C आणि 90°C दरम्यान असावे.

वितळणे वक्र व्याख्या: जर फक्त मुख्य शिखर 80°C-90°C दरम्यान दिसत असेल, तर याचा अर्थ फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक PCR परिपूर्ण आहे;जर मुख्य शिखर 80°C-90°C च्या दरम्यान दिसले आणि विविध शिखरे 80°C च्या खाली दिसली, तर मूलतः प्राइमर डायमरचा विचार केला जातो.त्याचे निराकरण करण्यासाठी आपण अॅनिलिंग तापमान वाढविण्याचा प्रयत्न करू शकता;जर मुख्य शिखर 80°C-90°C दरम्यान दिसले आणि तापमान वाढल्यावर विविध शिखर पुन्हा दिसू लागले, तर मुळात DNA दूषित आहे असे मानले जाते आणि प्रयोगाच्या सुरुवातीच्या टप्प्यावर DNA काढून टाकणे आवश्यक आहे.

अर्थात, अजूनही काही असामान्य परिस्थिती आहेत, ज्या खाली एक एक करून खंडित केल्या जातील.
3. प्रगत ज्ञान

qPCR करण्यासाठी, मला MIQE म्हणावे लागेल,किमान माहितीच्या प्रकाशनासाठीपरिमाणवाचकरिअल-टाइम पीसीआरप्रयोग — वास्तविक-वेळ परिमाणात्मक PCR बद्दल लेख प्रकाशित करण्यासाठी किमान माहितीप्रयोगप्रत्येकाची समज सुलभ करण्यासाठी, आम्ही मुख्य सामग्री सुलभ करू.

तुम्ही इंटरनेटवर MIQE चा मूळ मजकूर शोधू शकता आणि सर्वात महत्वाची गोष्ट म्हणजे तेलेख प्रकाशित करताना प्रदान करणे आवश्यक असलेली डेटा चेकलिस्ट .

हे तपशील वाचून समीक्षक प्रयोगाच्या गुणवत्तेचा न्याय करू शकतात;भविष्यातील वाचक प्रयोगाची पुनरावृत्ती करण्यासाठी किंवा सुधारण्यासाठी देखील याचा वापर करू शकतात.
हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की या यादीमध्ये, प्रत्येक यादीचे महत्त्व अनुक्रमे E किंवा D ने चिन्हांकित केले आहे.याचा अर्थ काय?ई: आवश्यक माहिती (सबमिट करणे आवश्यक आहे);डी: इष्ट माहिती (शक्य तितकी प्रदान करा).

MIQE (1)-प्रायोगिक डिझाइन
अनेक स्कंबॅग्स ज्यांनी त्यांचे पदवीचे शिक्षण पूर्ण केल्यानंतर त्यांचा बचाव पूर्ण केला आहे त्यांना स्वतंत्रपणे प्रयोग कसा बनवायचा, त्यांची नोटबुक उघडायची आणि शिक्षक त्यांना काय करायला सांगतात हे कळत नाही.परिणामी, प्रायोगिक रचना कठोर नव्हती, आणि मासिकाच्या संपादकीय विभागाने सांगितले की त्यांना हे चित्र आणि ते चित्र बनवायचे आहे, म्हणून त्यांनी ते धडपडत केले.अशा प्रकारे बनवले जातात स्कंबॅग्ज!

घराच्या जवळ, प्रयोगाचे पहिले तत्त्व निश्चित करणे आहेप्रायोगिक तर्कशास्त्राची कठोरता.प्रायोगिक रचना ही सर्वात मूलभूत गोष्ट आहे आणि प्रायोगिक डिझाइनची सर्वात महत्त्वाची गोष्ट म्हणजे लक्ष्य नमुना, संदर्भ नमुना (नियंत्रण) आणि पुनरावृत्तीची संख्या कशी सेट करायची, जेणेकरून प्रायोगिक डेटा संदर्भित, तुलना करता येईल आणि खात्रीलायक असेल.

लक्ष्य नमुनाविशिष्ट उपचारानंतर आम्हाला लक्ष्य जनुक शोधणे आवश्यक असलेल्या नमुन्याचा संदर्भ देते.संदर्भ नमुनाकोणत्याही उपचाराशिवाय नमुना आहे, ज्याला जीवशास्त्रात वन्य प्रकार म्हणून संबोधले जाते.

प्रायोगिक प्रतिकृतीखूप महत्वाचे आहेत.साधारणपणे, प्रेरक प्रतिकृतींची संख्या तीनपेक्षा जास्त असणे आवश्यक आहे.जैविक प्रतिकृती काय आहे आणि तांत्रिक प्रतिकृती काय आहे हे वेगळे करणे आवश्यक आहे.

जैविक प्रतिकृती: भिन्न सामग्री (वेळ, वनस्पती, बॅचेस, प्रतिक्रिया प्लेट्स) सह समान सत्यापन प्रयोग केले.

जैविक डुप्लिकेशन
उदाहरण म्हणून मिरचीची कीटकनाशक उपचार घेऊ.आम्हाला ABC च्या तीन झाडांवर कीटकनाशकांची फवारणी करायची आहे, नंतर ABC ची तीन झाडे तीन जैविक प्रतिकृती आहेत, आणि ते वेगवेगळ्या सामग्रीसह एकच पडताळणी प्रयोग आहेत.परंतु एक प्रयोग म्हणून, नियंत्रण निश्चितपणे आवश्यक आहे, म्हणून आम्ही वनस्पती A चा प्रायोगिक गट तयार करण्यासाठी वनस्पती A च्या एका फांद्यावर फवारणी करू शकतो आणि नियंत्रण गट तयार करण्यासाठी वनस्पती A च्या इतर फांद्यांची फवारणी करू शकत नाही.B आणि C साठी असेच करा.

तांत्रिक प्रतिकृती (तांत्रिक प्रतिकृती): हा एक पुनरावृत्तीचा प्रयोग आहे जो ऑपरेशनमुळे होणार्‍या त्रुटी टाळण्यासाठी डिझाइन केलेला आहे, जो प्रत्यक्षात समान सामग्रीमध्ये समाविष्ट केलेला डुप्लिकेट छिद्र आहे.दोन्ही उपचार आणि नियंत्रणांमध्ये लक्ष्य जनुक आणि अंतर्गत संदर्भ जनुकाची प्रतिकृती सेटिंग्ज (किमान तीन) असणे आवश्यक आहे.

तांत्रिक पुनरावृत्ती
पुन्हा उदाहरण म्हणून कीटकनाशकांवर उपचार केलेली मिरची घ्या.वनस्पती A च्या प्रायोगिक गटासाठी, आम्ही त्याच्या लक्ष्यित जनुकासाठी आणि अंतर्गत संदर्भ जनुकासाठी अनुक्रमे 1, 2, आणि 3 चे तीन पीसीआर छिद्र केले, जेणेकरून शोधानंतर सरासरी काढता येईल.वनस्पतींच्या नियंत्रणासाठी अ गटांवरही त्याच पद्धतीने उपचार केले जातात.त्याचप्रमाणे बी आणि सी वनस्पतींसाठी समान प्रक्रिया करा.ही तांत्रिक पुनरावृत्ती आहे.

हे लक्षात घेण्यासारखे आहेसांख्यिकीमध्ये काय प्रवेश करते ते जैविक पुनरावृत्ती आहे, आणि तांत्रिक पुनरावृत्ती म्हणजे प्रायोगिक प्रक्रियेत काही यादृच्छिक घटना आहेत की नाही हे तपासणे, जेणेकरुन प्रायोगिक परिणाम विश्वासार्ह बनवता येतील, म्हणजेच, आपण नेहमी म्हणतो त्याप्रमाणे त्यांची सरासरी घेऊन त्रुटी टाळणे.

नकारात्मक नियंत्रणे-NTC आणि NRT
NTC (नो-टेम्पलेट नियंत्रण), टेम्प्लेट नसलेले नियंत्रण, प्रायोगिक सामग्री दूषित आहे की नाही हे सत्यापित करण्यासाठी वापरले जाते.साधारणपणे, पाणी साचा म्हणून वापरले जाते.जर फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया असेल तर ते सूचित करते की प्रयोगशाळेत न्यूक्लिक अॅसिड दूषित झाले आहे.

हे प्रदूषण यातून येतात: अशुद्ध पाणी, अंतर्जात डीएनए असलेले अयोग्य अभिकर्मक, प्राइमर प्रदूषण, प्रयोगशाळेतील उपकरणांचे प्रदूषण, एरोसोल प्रदूषण इ., RNase स्कॅव्हेंजर आणि RNase इनहिबिटर वापरणे आवश्यक आहे.एरोसोल प्रदूषण शोधणे सर्वात कठीण आहे.कल्पना करा की तुमची प्रयोगशाळा धुक्यासारखी आहे, ज्यामध्ये विविध न्यूक्लिक अॅसिड हवेत निलंबित आहेत.

NRT (नो-रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस), रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनशिवाय नियंत्रण, नॉन-रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन केलेले RNA हे नकारात्मक नियंत्रण आहे, जे gDNA अवशेषांचे नियंत्रण आहे.

जनुक अभिव्यक्ती करताना, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शननंतर सीडीएनएचे प्रमाण शोधून आरएनएचे प्रमाण शोधले जाते.आरएनए शुद्ध झाल्यावर जीडीएनए अवशेष असल्यास, ते प्रायोगिक परिणामांमध्ये त्रुटी निर्माण करेल, कारण वास्तविक परिणाम जीडीएनए आणि सीडीएनए आहेत.एकूण स्तरावर, केवळ सीडीएनएच नाही तर आरएनए काढताना जीडीएनए पूर्णपणे काढून टाकणे आवश्यक आहे.

MIQE (2)-नमुना माहिती
तथाकथित नमुना माहितीचा अर्थ असा आहे की जेव्हा आम्ही qPCR बद्दल लेख प्रकाशित करतो, तेव्हा आम्ही नमुना माहिती स्पष्टपणे स्पष्ट केली पाहिजे, जी लेखाचा एक अपरिहार्य भाग आहे.त्याचप्रमाणे, जेव्हा आम्ही नमुन्यांची प्रक्रिया करतो, तेव्हा नमुन्यांची वैधता सुनिश्चित करण्यासाठी आम्ही आमच्या स्वतःच्या ऑपरेशन्सचे नियमन देखील केले पाहिजे.

नमुन्याचे वर्णन केवळ एक परिणाम आहे आणि आम्ही संपूर्ण प्रयोगादरम्यान घेतलेल्या सामग्रीकडे अधिक लक्ष दिले पाहिजे.

प्रायोगिक सामग्रीची निवड
रक्ताचे नमुने - ताजे रक्त निवडा, 4 तासांपेक्षा जास्त नाही.सेल नमुने - जोमदार वाढीच्या काळात ताज्या पेशी गोळा करणे निवडा.प्राण्यांच्या ऊती - ताजे, जोमाने वाढणारे ऊतक निवडा.वनस्पती ऊतक - ताजे, तरुण ऊतक निवडा.

या काही वाक्यांमध्ये एक महत्त्वाचा शब्द आहे हे तुमच्या लक्षात आले असेल: fresh.
वरील नमुन्यांसाठी, बाजारातील सर्वोत्तम, किफायतशीर आणि स्थिर किट हे फोरजीनचे किट आहे, जे त्यांचे DNA आणि RNA पटकन आणि सहज काढू शकते.

रक्त डीएनए मिनी किट

सेल टोटल आरएनए अलगाव किट

प्राणी एकूण आरएनए अलगाव किट

प्लांट टोटल आरएनए आयसोलेशन किट

प्लांट टोटल आरएनए आयसोलेशन किट प्लस

प्लांट डीएनए आयसोलेशन किट

प्रायोगिक साहित्याचा संग्रह
सर्वसाधारणपणे, परिस्थिती परवानगी असल्यास आम्ही नमुने संग्रहित करण्याची शिफारस करत नाही.तथापि, असे बरेच मित्र आहेत जे नमुने घेतल्यानंतर लगेच प्रयोग करू शकत नाहीत आणि काहींना सॅम्पलिंगसाठी लिक्विड नायट्रोजन टाक्या शेतात घेऊन जाव्या लागतात.

या प्रकारच्या मेहनती मित्रासाठी, मी एवढेच म्हणू शकतो की तुम्हाला अभिकर्मक उपभोग्य वस्तू समजत नाहीत.आता बर्‍याच अभिकर्मक उपभोग्य कंपन्या अभिकर्मक तयार करतात जे खोलीच्या तपमानावर RNA नमुने साठवू शकतात आणि आपण ते वापरणे निवडू शकता.पारंपारिक स्टोरेज पद्धत म्हणजे लिक्विड नायट्रोजन स्टोरेज, एक लहान लिक्विड नायट्रोजन टाकी वापरणे जे वाहून नेण्यास सोपे आहे.नमुना प्रयोगशाळेत परत आणल्यानंतर, ते -80°C रेफ्रिजरेटरमध्ये ठेवा.

RNA चा समावेश असलेल्या प्रयोगांसाठी, सहा-शब्दांच्या तत्त्वाचे पालन करणे आवश्यक आहे:कमी तापमान, एंजाइम नाही,आणिजलद .

कमी तापमानाची संकल्पना समजणे सोपे आहे;एन्झाइम्सशिवाय, आपण ज्या जगात राहतो त्या जगात RNase सर्वत्र आहे (अन्यथा तुम्हाला HIV ने मारले असते), त्यामुळे प्रयोग करताना RNase कसे टाळायचे ही एक अतिशय महत्त्वाची संकल्पना आहे;जलदजगात असा एकही कुंग फू नाही ज्याला तोडता येत नाही, फक्त वेग तोडता येत नाही.

म्हणून, एका अर्थाने, काढण्याची वेळ जितकी कमी असेल तितके किट चांगले.का करतोफोरजीनच्या किट वेगावर जोर देतात, कारण त्यांना ते चांगले माहित आहे.

ता.क.: काही मुली अतिशय काळजीपूर्वक प्रयोग करतात, परंतु अनेक वर्षांच्या कामानंतर त्या स्लॅम डंकसारख्या चांगल्या नसतात.त्यांना वाटते की देव अन्यायकारक आहे, इतरांबद्दल तक्रार करतो आणि जीवन शोधत असतो.खरं तर, तिला ते समजले नाही.त्याने आरएनएचे चांगले संरक्षण केले नाही आणि स्लॅम डंक प्लेअर चपळ होता.जेव्हा तो प्रयोग करत होता तेव्हा त्याला वाटले की तो स्लॅम डंक तीन वेळा, पाच वेळा आणि दोन विभागांसह पूर्ण करेल, परंतु त्याने प्रयोग चांगला केला.

नोंद: हळू, RNase आक्रमणाची अधिक शक्यता.वेगवान होण्यासाठी स्वतःला कसे प्रशिक्षित करावे?कोणताही मार्ग नाही, फक्त अधिक सराव करा.

वेगवेगळ्या प्रयोगांसाठी आणि वेगवेगळ्या नमुन्यांसाठी, अजून साहित्य वाचणे आणि प्रक्रियेसाठी योग्य पद्धत निवडणे आवश्यक आहे.नमुना संकलन आणि साठवण प्रक्रियेसाठी, MIQE ला ते पेपरमध्ये स्पष्टपणे लिहिलेले असणे आवश्यक आहे, जेणेकरून समीक्षक पेपरच्या विश्वासार्हतेचे पुनरावलोकन करू शकतील आणि स्तब्ध झालेल्या तरुणांना तुमचा प्रयोग पुन्हा करणे देखील सोयीचे आहे.

जैविक प्रयोग अवघड असले तरी ते उच्च दर्जाचे आहेत.जर तुम्ही सावधगिरी बाळगली नाही तर तुम्ही जग उलथून टाकू शकता.उदाहरणार्थ, SARS ला जैवरासायनिक संकटात आणणे किंवा 1.3 अब्ज लोकांना वाचवण्यासाठी संकरित तांदूळ बनवणे.खालील चित्र एक रासायनिक प्रयोग आहे, त्याचे डिकसारखे स्वरूप पाहून तुम्हाला तुमच्या संशोधनाचा किती अभिमान आहे हे समजले पाहिजे.विसरा, त्याला काळे करू नका.

MIQE (3) - न्यूक्लिक अॅसिड काढणे.
न्यूक्लिक अॅसिड काढणे ही एक मोठी घटना आहे आणि सर्व आण्विक जीवशास्त्र प्रयोग न्यूक्लिक अॅसिड काढण्यापासून सुरू होतात.सर्व प्रथम, न्यूक्लिक अॅसिड काढण्यावर MIQE ची सामग्री कॉपी करूया.

हा फॉर्म पाहता, आपण पृष्ठभागावर राहू शकत नाही.फॉर्म हा एक सिद्धांत आहे.उत्कृष्ट विद्यार्थी होण्यासाठी, आपण का विचारले पाहिजे.या सारणीची आवश्यक सामग्री आहे: पाठपुरावाRNA ची शुद्धता, अखंडता, सातत्य आणि निष्कर्षण रक्कम .

चा पहिला भागप्रक्रिया किंवा साधन ही न्यूक्लिक अॅसिड काढण्याची पायरी आहे.तुम्ही काढण्यासाठी स्वयंचलित न्यूक्लिक अॅसिड एक्स्ट्रॅक्टर वापरत असल्यास (प्रगत, कृपया खरेदीसाठी माझ्याशी संपर्क साधा), तुम्हाला इन्स्ट्रुमेंटचे मॉडेल नाव सूचित करावे लागेल.

किटचे नाव आणि

बदलाच्या तपशीलासाठी कोणते किट वापरले गेले, कोणते विशेष अभिकर्मक जोडले गेले किंवा कोणती विशेष ऑपरेशन्स केली गेली हे स्पष्टपणे स्पष्ट केले पाहिजे जेणेकरुन इतरांना तुमचा प्रयोग सहजपणे पुन्हा करता येईल.

काही लोक विशेष नमुने काढताना काही विशेष अभिकर्मक जोडतात, हे त्यांचे गुप्त शस्त्र आहे आणि इतरांना सांगू नका.ते गुप्त ठेवताना, ते आपला लेख चमकण्याची संधी देखील गमावतात.हुशार होऊ नका, वैज्ञानिक संशोधनात तुम्हाला देशाच्या जुन्या झांगपेक्षा अधिक प्रामाणिक असले पाहिजे, जर तुम्हाला हुशार व्हायचे असेल तर लेख तुम्हाला मूर्ख बनवेल.

किटचा उत्पादन क्रमांक लक्षात ठेवणे आवश्यक आहेजेव्हा तुम्ही किट ऑर्डर करता आणि लेख लिहिता.किटवर साधारणपणे दोन क्रमांक असतात: कॅट-कॅटलॉग क्रमांक (उत्पादन क्रमांक, लेख क्रमांक), लॉट-उत्पादन संख्या (उत्पादन कोणत्या बॅचमधून आले आहे हे दर्शवण्यासाठी वापरले जाते).

याव्यतिरिक्त, जैवरासायनिक अभिकर्मक ऑर्डर करताना CAS क्रमांकाचा वापर केला जातो आणि मी ते एकत्र लोकप्रिय करीन.CAS क्रमांक हा प्रत्येक नवीन रासायनिक औषधाला अमेरिकन केमिकल सोसायटीने दिलेला क्रमांक आहे.साधारणपणे, तीन क्रमांक एका डॅशने जोडलेले असतात.रुशुईचा CAS क्रमांक: ७७३२-१८-५.रसायनांमध्ये अनेकदा अनेक उपनावे असतात, परंतु CAS क्रमांक अद्वितीय असतो.औषधाची ऑर्डर देताना, तुम्ही त्याचा CAS क्रमांक आधी तपासू शकता.

घराजवळ, या गोष्टींचे स्पष्ट वर्णन का करावे लागते?खरं तर, हे आरएनए निष्कर्षणाची गुणवत्ता तपासण्यासाठी देखील आहे.उपकरणे आणि किट्सचा वापर RNA निष्कर्षण अधिक सुसंगत करेल.सामान्य प्रयोगशाळांचे एक्सट्रॅक्शन स्केल मोठे नसते आणि ते किटसह मिळू शकते.

DNase किंवा RNase उपचारांचा तपशील
फ्लोरोसेंट क्वांटिटेटिव्ह पीसीआरचा महत्त्वाचा मुद्दा म्हणजे डीएनए दूषित होण्यापासून रोखणे आणि दूषित झाल्यास प्रयोग करू नका.म्हणून, प्रायोगिक प्रक्रियेतील डीएनए पूर्णपणे आणि पूर्णपणे काढून टाकला गेला आहे हे दाखवण्यासाठी तुम्ही डीएनएवर प्रक्रिया करण्यासाठी वापरलेली प्रक्रिया सांगणे अत्यावश्यक आहे.योजनाबद्ध आकृतीद्वारे दर्शविले जाते.

आरएनए आणि डीएनएचे योजनाबद्ध आकृती
सर्वसाधारणपणे, डीएनए काढून टाकण्याची पद्धत म्हणजे आरएनएचा डीएनएस काढल्यानंतर उपचार करणे.तथापि, या तुलनेने जुन्या पद्धती आहेत.कमर्शियल आरएनए एक्स्ट्रॅक्शन किट डीएनएस न जोडता एक्सट्रॅक्शन प्रक्रियेदरम्यान डीएनए काढण्यात सक्षम आहेत.उदाहरणार्थ, Foregene मधील किटची मालिका.

नोंद: RNA काढताना DNA काढणे ही एक अतिशय धोकादायक दुधारी तलवार आहे, जी RNA काढण्याच्या ऑपरेशनची वेळ वाढवेल आणि RNA ऱ्हास होण्याचा धोका वाढवेल.मुळात, हे आरएनए उत्पन्न आणि शुद्धता यांच्यातील व्यापार-बंद आहे.

याव्यतिरिक्त, सिलिका-आधारित शोषण स्तंभामध्ये जोडलेले DNase चे प्रमाण फारच कमी आहे आणि परिणाम साध्य करण्यासाठी उच्च-गुणवत्तेचा DNase वापरणे आवश्यक आहे.ऑप्टिमाइझ न केलेले DNase लवकर आणि पूर्णपणे पचले जाऊ शकत नाही.ही व्यापाऱ्याच्या तांत्रिक पातळीची चाचणी आहे.अर्थात, आणखी विचित्र व्यापारी आहेत जे डीएनए डीएनएसशिवाय काढले जाऊ शकतात अशी बढाई मारतात.असे म्हणता येईल की जो कोणी डीएनए शिवाय डीएनए पूर्णपणे काढून टाकला जाऊ शकतो अशी फुशारकी मारतो तो गुंड आहे.डीएनए ही तुलनेने स्थिर दुहेरी अडकलेली रचना आहे आणि ती फक्त बोलून आणि हसून पुसली जाऊ शकत नाही.

दूषिततेचे मूल्यांकन
मूल्यांकन पद्धत: इलेक्ट्रोफोरेसीस डिटेक्शन, 1% अॅग्रोज, 6V/सेमी, 15 मिनिट, लोडिंग 1-3 उल

न्यूक्लिक अॅसिड परिमाणवाचक विश्लेषण
हे सहसा यूव्ही स्पेक्ट्रोफोटोमीटर वापरून मोजले जाते.मी प्रथम OD260, OD280 आणि OD230 या तीन मूल्यांचा अर्थ लोकप्रिय करू.
·OD260nm: ही न्यूक्लिक अॅसिडच्या सर्वोच्च शोषण शिखराची शोषण तरंगलांबी आहे आणि सर्वोत्तम मोजलेले मूल्य 0.1 ते 1.0 पर्यंत आहे.जर नसेल तर, नमुना मर्यादेत आणण्यासाठी पातळ करा किंवा केंद्रित करा.
·OD280nm: ही प्रथिने आणि फिनोलिक पदार्थांच्या सर्वोच्च शोषण शिखराची शोषण तरंगलांबी आहे.
·OD230nm: ही कार्बोहायड्रेट्सच्या सर्वोच्च शोषण शिखराची शोषण तरंगलांबी आहे.

पुढे, प्रत्येक निर्देशकाच्या भूमिकेबद्दल बोलूया.A260 साठी, हे न्यूक्लिक अॅसिडचे उत्पादन मोजण्यासाठी वापरले जाऊ शकते.जेव्हा OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

शुद्धतेसाठी, आम्हाला सामान्यतः OD260/280 आणि OD260/230 असे गुणोत्तर पहावे लागतील.
· शुद्ध DNA: OD260/280 अंदाजे 1.8 च्या समान आहे.जेव्हा ते 1.9 पेक्षा जास्त असते तेव्हा ते RNA प्रदूषण असल्याचे सूचित करते आणि जेव्हा ते 1.6 पेक्षा कमी असते तेव्हा ते प्रथिने आणि फिनॉल प्रदूषण असल्याचे सूचित करते.
शुद्ध आरएनए: 1.7
·OD260/230: डीएनए असो वा आरएनए, संदर्भ मूल्य २.५ आहे.जेव्हा ते 2.0 पेक्षा कमी होते, तेव्हा ते सूचित करते की साखर, मीठ आणि सेंद्रिय पदार्थांचे प्रदूषण आहे.

आरएनए अखंडता

RNA ची अखंडता मोजणे फार महत्वाचे आहे.साधारणपणे, 28S आणि 18S RNA मधील ब्राइटनेसचा दुहेरी संबंध आहे की नाही हे तपासण्यासाठी RNA denaturation gel प्रयोग करणे आवश्यक आहे.जेव्हा तिसरा बँड 5S दिसतो, तेव्हा याचा अर्थ असा होतो की अपृष्ठवंशी प्राणी वगळता RNA क्षीण होऊ लागला आहे.

RNA गुणवत्तेचे मूल्यांकन करण्यासाठी डेटा: वरील चाचण्यांव्यतिरिक्त, RNA अखंडतेच्या दृष्टीने आणखी काही प्रगत साधन चाचण्या आहेत, जसे की एक्सपेरियन ऑटोमॅटिक इलेक्ट्रोफोरेसीस सिस्टमची RQI अखंडता चाचणी, ज्यामुळे RNA अदृश्यपणे खराब झाले आहे की नाही हे शोधू शकते.

वैज्ञानिक संशोधनामध्ये, फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक पीसीआर ही लक्ष्य जनुक आणि अंतर्गत संदर्भ जनुक यांच्यातील तुलना आहे.म्हणून, आरएनए नमुना संरक्षण, आरएनए काढणे इत्यादी प्रक्रियेत, आरएनएची अखंडता सुनिश्चित करणे हे प्राथमिक ध्येय आहे.

आरएनएची अखंडता लक्ष्य जनुक आणि अंतर्गत संदर्भ जनुक यांच्यातील संतुलनावर कसा परिणाम करते हे खालील आकृतीवरून सहज समजू शकते.अधोगतीमुळे जीन अपूर्णता येते, मग ती अंतर्गत संदर्भ जनुकाची अपूर्णता असो किंवा लक्ष्यित जनुकाची अपूर्णता असो, त्याचा डेटावर मोठा परिणाम होईल.

लक्ष्य जनुक आणि संदर्भ जनुकाचे योजनाबद्ध आकृती, सत्य नसावे

प्रतिबंध चाचणी (सीटी मूल्य उच्च किंवा कमी एकाग्रता किंवा इतर परिस्थितींमध्ये दाबले गेले आहे का)

ही आकृती उदाहरण म्हणून घेतल्यास, पाच वक्रांची Ct मूल्ये खालीलप्रमाणे आहेत.वक्रांमधील CT मूल्यांचे वितरण असमान आहे, आणि Ct मूल्ये उच्च आणि कमी सांद्रता अंतर्गत विलंबित आहेत, जे PCR प्रतिबंधाचे प्रकरण आहे.

कळीचा मुद्दा: RNA काढण्याच्या प्रक्रियेत, आपण गैरसमज सोडून दिले पाहिजेत आणि योग्य ते स्थापित केले पाहिजेत.

चुकीची कल्पना आहे: RNA काढणे केवळ उत्पन्नाचा पाठपुरावा करते, असा विचार करते की आरएनए जितके मोठे असेल तितके चांगले.खरं तर, जेव्हा आपण प्रमाणीकरण करतो, जर जनुकांची संख्या फार मोठी नसेल, तर आपल्याला जास्त RNA ची गरज नसते.तुम्ही काढलेल्या आरएनएचे प्रमाण पुरेसे आहे.

योग्य संकल्पना आहे:आरएनए निष्कर्षण शुद्धता, अखंडता आणि सातत्य राखले पाहिजे.शुद्धता हे सुनिश्चित करू शकते की त्यानंतरचे रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रतिबंधित केले जाणार नाही आणि डेटावर डीएनएचा परिणाम होणार नाही.अखंडता लक्ष्य अनुक्रम आणि अंतर्गत संदर्भांचे संतुलन सुनिश्चित करते.सुसंगतता स्थिर नमुना लोडिंग सुनिश्चित करते.

MIQE (4) - उलट प्रतिलेखन
गैरसमज: उच्च नमुना व्हॉल्यूमचा पाठपुरावा.
योग्य संकल्पना: RNA कितीही लोड केले आहे याची पर्वा न करता, सुसंगतता (स्थिरता) चा पाठपुरावा करा, उलट प्रतिलेखनाची कार्यक्षमता सुसंगत राहते, हे सुनिश्चित करून की cDNA मधील फरक mRNA मधील फरक खरोखरच प्रतिबिंबित करू शकतात.
आम्ही ही प्रक्रिया योजनाबद्ध आकृतीसह स्पष्ट करतो:

उलट प्रतिलेखन कार्यक्षमतेचे योजनाबद्ध आकृती, सत्य असू नका
सर्वप्रथम, आपल्याला रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रक्रिया आणि पीसीआर प्रक्रियेमधील फरक समजून घेणे आवश्यक आहे.पीसीआरमध्ये अनेक हीटिंग आणि अॅनिलिंग प्रक्रिया होतात आणि लक्ष्य तुकडा वेगाने वाढतो;रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनमध्ये ही प्रक्रिया नसतानाही, आम्ही कल्पना करू शकतो की रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रत्यक्षात एक-टू-वन प्रतिकृती प्रक्रियेदरम्यान, आरएनएचे अनेक तुकडे

सीडीएनए माहितीचे जितके तुकडे आहेत तितके मिळू शकतात, हे आत्तापर्यंत समजले पाहिजे, कारण लहान आणि मोठे तुकडे उलटे लिप्यंतरण केले गेले आहेत आणि एका तुकड्यावर लक्ष केंद्रित करणे अशक्य आहे.आणि RNA चे प्रमाण तुलनेने कमी असल्यामुळे, CDNA ची मात्रा देखील तुलनेने लहान आहे, PCR च्या विपरीत, ज्याचा प्रवर्धन प्रभाव आहे, त्यामुळे ते शोधणे मुळात अशक्य आहे.

सीडीएनए इलेक्ट्रोफोरेसीस परिणाम
दुसरे म्हणजे, आदर्शपणे, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन वन-टू-वन केले जाते, परंतु कोणत्याही कंपनीकडून कोणताही रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस हा परिणाम साध्य करू शकत नाही.मूलभूतपणे, बहुतेक उलट ट्रान्सक्रिप्टेसची कार्यक्षमता 30-50% च्या दरम्यान फिरते.असे असल्यास, आमच्याकडे तुलनेने स्थिर रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन कार्यक्षमता असेल, जी आम्हाला आकृतीमध्ये पहायची आहे: 3 RNAs 2 cDNAs, 6 RNAs 4 cDNA मिळवतात, त्यामुळे कितीही नमुना लोड केला असला तरीही, उलट प्रतिलेखन कार्यक्षमता तुलनेने स्थिर असते.रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन कार्यक्षमता अस्थिर आहे आणि उच्च एकाग्रता प्रतिबंधित आहे अशी परिस्थिती आम्ही पाहू इच्छित नाही.

तर, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनची कार्यक्षमता स्थिर आहे की नाही हे कसे तपासायचे?पद्धत अगदी सोपी आहे, तुम्हाला फक्त एक तुलना चाचणी करायची आहे: एक म्हणजे RNA च्या दुप्पट dilution नंतर cDNA मध्ये रिव्हर्स ट्रान्स्क्राइब करणे आणि दुसरे म्हणजे cDNA मध्ये रिव्हर्स लिप्यंतरण केल्यावर दुप्पट डायल्युशन करणे, आणि नंतर qPCR करून मिळवलेला उतार पाहणे हे सुसंगत आहे का.एक अव्वल विद्यार्थी म्हणून, तुम्ही ते काही सेकंदात समजून घेतले पाहिजे.खाली दाखविल्याप्रमाणे:

रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनची कार्यक्षमता स्थिर आहे की नाही हे तपासण्यासाठी RNA आणि cDNA चे सौम्य करणे
रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस आणि किट
फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक पीसीआरमध्ये उत्कृष्ट रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस आणि किट कसे असू शकतात.रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस स्त्रोतानुसार दोन प्रकारांमध्ये विभागले गेले आहे, एएमव्ही किंवाM-MLV, आणि त्यांची कामगिरी सारणीमध्ये दर्शविल्याप्रमाणेच आहे.

RNase H क्रियाकलाप
RNase H हे Ribonuclease H आहे, चायनीज नाव ribonuclease H आहे, जे एंडोरिबोन्यूक्लिझ आहे जे DNA-RNA संकरित शृंखलामध्ये RNA चे हायड्रोलायझ करू शकते.RNase H एकल-असरलेल्या किंवा दुहेरी-असरलेल्या DNA किंवा RNA मध्ये फॉस्फोडीस्टर बाँड्सचे हायड्रोलायझ करू शकत नाही, म्हणजेच ते सिंगल-स्ट्रँडेड किंवा डबल-स्ट्रँडेड DNA किंवा RNA पचवू शकत नाही.सामान्यतः cDNA च्या दुसऱ्या स्ट्रँडच्या संश्लेषणात वापरले जाते.

ही एक विचित्र गोष्ट आहे.आम्ही म्हणतो की रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसमध्ये RNase H क्रियाकलाप असतो, असे नाही की रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसमध्ये RNase H असते, आणि RNase H रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसपासून वेगळे करणे शक्य नसते, कदाचित रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसमधील विशिष्ट गटांच्या संरचनेमुळे ही क्रिया रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसमुळे होते.

म्हणून, AMV ची उच्च रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन कार्यक्षमता लक्षात न घेता, त्याची RNase H क्रियाकलाप cDNA चे उत्पन्न कमी करते.अर्थात, सीडीएनएचे उत्पन्न वाढवण्यासाठी रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसमधील RNase H क्रियाकलाप दूर करण्यासाठी अभिकर्मक उत्पादक सतत त्यांची उत्पादने अनुकूल करत आहेत.
एनीलिंग तापमान

वेगवेगळ्या तापमानात आरएनएची दुय्यम रचना
वेगवेगळ्या तापमानात आरएनएच्या दुय्यम संरचनेसाठी वरील आकृती पहा आणि विशिष्ट तापमान आणि मीठ एकाग्रतेच्या परिस्थितीत लक्ष्य तुकड्याची दुय्यम रचना निश्चित करण्यासाठी mFold ऑनलाइन टूल वापरा.55°C वर, RNA ची दुय्यम रचना अजूनही खूप गुंतागुंतीची आहे, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस कार्य करू शकत नाही आणि 65°C पर्यंत दुय्यम रचना पूर्णपणे सोडवता येत नाही, तर AMV आणि M-MLV चे इष्टतम तापमान या तापमानापेक्षा खूपच कमी आहे.
काय करायचं?दुय्यम रचना ही टेम्पलेटचीच पूरक जोडणी आहे, ज्यामुळे प्राइमर आणि रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस आणि टेम्प्लेट यांच्यात मजबूत स्पर्धा होते, परिणामी कमी E आणि खराब पुनरावृत्तीक्षमता यासारख्या समस्यांची मालिका होते.

काय करायचं?फक्त अॅनिलिंग तापमान शक्य तितके वाढवा.

अनेक अभिकर्मक उत्पादक जनुकीय अभियांत्रिकीद्वारे त्यांचे रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस सुधारत आहेत.काही प्रतिक्रिया तापमान वाढवतात, जसे की जिफान आणि आयडेलाई, आणि काही एंझाइम आणि आरएनए टेम्पलेटमधील आत्मीयता सुधारण्यासाठी RNase H एन्झाइमचा सक्रिय गट काढून टाकतात.उच्च आत्मीयता स्पर्धात्मकपणे दुय्यम रचना पिळून काढू शकते आणि सहजतेने वाचू शकते आणि उलट प्रतिलेखनाच्या कार्यक्षमतेत देखील मोठ्या प्रमाणात सुधारणा करू शकते.
महत्त्वाचा मुद्दा: रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन (एन्झाइम केवळ कार्यक्षम नसून ते स्थिर देखील असले पाहिजेत) रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन कार्यक्षमतेचा पाठपुरावा करणे अधिक महत्त्वाचे आहे, जर ते विशेषत: मोठ्या प्रमाणात फ्लूरोसंट परिमाणात्मक PCR नसेल तर ते अजिबात शक्य होणार नाही.एकाधिक सीडीएनए.
विविध उत्पादकांनी सातत्य राखण्यासाठी काही प्रयत्नही केले आहेत.उदाहरणार्थ, बर्‍याच कंपन्यांनी आता विक्रीसाठी मानक किट म्हणून रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन पॅकेज केले आहे, जो एक चांगला पर्याय आहे.
उदाहरणार्थ, Foregene च्या RT Easy Series किट:

आरटी इझी I (प्रथम स्ट्रँड सीडीएनए संश्लेषण किटसाठी मास्टर प्रीमिक्स)

MIQE (5) - लक्ष्य जनुक माहिती

वरील आकृती स्पष्ट करते
1. हे जनुक वारंवार प्रयोगांसाठी प्रभावी आहे की नाही हे सामान्यत: वारंवार प्रयोगांनी सत्यापित केले जाऊ शकते.
2. जीन आयडी, तुम्हाला माहिती आहे.
3. जनुकाची लांबी, लक्ष्य जनुकाची एकूण लांबी निश्चितपणे कोणतीही समस्या नाही.प्राइमर डिझाइन करताना, अॅम्प्लीकॉनची लांबी 80-200bp च्या दरम्यान असल्याची खात्री करा जेणेकरून चांगली प्रवर्धन कार्यक्षमता सुनिश्चित होईल.
4. अनुक्रम स्फोट तुलना माहिती, लक्ष्यित जनुकाची तुलना जीनबँकमध्ये गैर-विशिष्ट प्रवर्धन टाळण्यासाठी करणे आवश्यक आहे.
5. स्यूडोजेन्सची उपस्थिती.स्यूडोजीन हा सामान्य जीनसारखाच डीएनए क्रम असतो परंतु त्याचे सामान्य कार्य गमावतो.हे बहुधा युकेरियोट्सच्या बहु-जीन कुटुंबात असते.हे सहसा ψ द्वारे दर्शविले जाते.ही जीनोममधील नॉन-फंक्शनल जीनोमिक डीएनए प्रत आहे जी कोडिंग जीन अनुक्रमासारखी असते., सामान्यत: लिप्यंतरण केले जात नाही आणि त्यांचा कोणताही स्पष्ट शारीरिक अर्थ नाही.
6. एक्सॉन्स आणि इंट्रोन्सच्या सापेक्ष प्राइमर्सची स्थिती.सुरुवातीच्या काळात, जेव्हा आम्ही DNA दूषित होण्याच्या समस्येचे निराकरण केले, तेव्हा आम्ही अनेकदा प्राइमर्स, एक्सॉन्स आणि इंट्रोन्सच्या पोझिशनकडे लक्ष दिले आणि सामान्यतः डीएनए अॅम्प्लीफिकेशन टाळण्यासाठी इंट्रोन्समध्ये प्राइमर्स डिझाइन करण्याचा विचार केला.कृपया खालील आकृती पहा: काळा इंट्रोन्सचे प्रतिनिधित्व करतो, विविध ब्लूज एक्सॉन्सचे प्रतिनिधित्व करतात, गुलाबी सामान्य प्राइमर्सचे प्रतिनिधित्व करतात आणि चमकदार लाल इंट्रॉन-स्पॅनिंग प्राइमर्सचे प्रतिनिधित्व करतात.

योजनाबद्ध, कधीही खरे नाही
ही किती परिपूर्ण योजना दिसते, परंतु प्रत्यक्षात, बहुतेक प्रकरणांमध्ये, ट्रान्स-इंट्रॉन प्राइमर्स कल्पनेइतके जादुई नसतात आणि ते विशिष्ट नसलेल्या प्रवर्धनास कारणीभूत देखील असतात.त्यामुळे डीएनए दूषित होण्यापासून रोखण्याचा सर्वोत्तम मार्ग म्हणजे डीएनए पूर्णपणे काढून टाकणे.
7. रचना अंदाज.हे उदाहरण पुन्हा वापरून, विशिष्ट तापमान आणि मीठ एकाग्रतेवर लक्ष्य तुकड्याची दुय्यम रचना निश्चित करण्यासाठी mFold ऑनलाइन साधन वापरा.

वेगवेगळ्या तापमानात आरएनएची दुय्यम रचना
दुय्यम रचना ही टेम्प्लेटचीच पूरक जोडणी आहे, ज्यामुळे प्राइमर आणि टेम्प्लेट पेअरिंगमध्ये जोरदार स्पर्धा होईल आणि प्राइमर बंधनकारक होण्याची शक्यता कमी आहे, परिणामी कमी E आणि खराब पुनरावृत्तीक्षमता यासारख्या समस्यांची मालिका निर्माण होईल.सॉफ्टवेअर अंदाजाद्वारे, दुय्यम संरचना समस्या नसल्यास, ते खूप चांगले होईल.तेथे असल्यास, आमचा पाठपुरावा लेख या समस्येचे निराकरण कसे करावे याबद्दल विशेषतः चर्चा करेल.

MIQE (6)-qPCR ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स

फ्लोरोसेंट क्वांटिटेटिव्ह पीसीआरसाठी, तुम्हाला दररोज संघर्ष करावा लागणारी पहिली गोष्ट म्हणजे आरएनए काढणे आणि दुसरी गोष्ट प्राइमर डिझाइन असू शकते.
सर्व प्रथम, आम्ही अजूनही MIQE चेकलिस्टनुसार प्राइमर डिझाइनबद्दलचे नियम तपासतो.हे इतके सोपे आहे की स्कंबॅग हसू शकतात आणि आम्ही ते एका वाक्यात पूर्ण करू शकतो: प्राइमर प्रोबचा क्रम आणि स्थिती आणि बदल पद्धती शोधा.प्राइमर शुद्धीकरण पद्धतीसाठी, प्राइमर संश्लेषण सध्या खूप स्वस्त आहे, qPCR हे PAGE आणि त्यावरील शुद्धीकरण पद्धतींसाठी योग्य आहे आणि संश्लेषण साधनाची माहिती महत्त्वाची नाही.बरेच लोक अनेक दशकांपासून प्राइमर्स करत आहेत आणि त्यांना हे माहित नाही की सिंथेसायझर ABI3900 आहे.
प्राइमर डिझाइनच्या तत्त्वांबद्दल, तुम्हाला ते रॉट करून लक्षात ठेवण्याची गरज नाही, कारण बहुतेक प्राइमर डिझाइन सॉफ्टवेअर किंवा ऑनलाइन टूल्स या समस्यांची काळजी घेऊ शकतात (शिफारस केलेले ऑनलाइन टूल primer3.ut.ee/), आणि 99.999% प्राइमर डिझाइन मॅन्युअली केले जात नाही, पहा, लेखक कधीकधी शेकडो प्राइमर्स डिझाइन करतो, जर तुम्ही ते एक-एक करून वाचले तर ते पुढे जाईल.
प्राइमर्स डिझाइन केल्यानंतर फक्त खालील मुद्दे तपासा:
1. 3′ टोकाच्या जवळ प्राइमर डिझाइन करा: cDNA फर्स्ट-स्ट्रँड सिंथेसिससाठी ऑलिगो डीटी प्राइमर्स वापरण्याच्या बाबतीत, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन कार्यक्षमता आणि RNA अखंडता लक्षात घेऊन, प्रवर्धन कार्यक्षमता सुधारण्यासाठी डिझाइन केलेले प्राइमर्स 3′ टोकाच्या जवळ डिझाइन केले जाणे आवश्यक आहे.खालीलप्रमाणे स्पष्ट करण्यासाठी चित्र वापरा (हे समजण्याचा कोणताही मार्ग नाही):

प्राइमर्स 3′ टोकाच्या जवळ का डिझाइन केले पाहिजेत, ते खरे नसावे
2. TM मूल्य: Tm मूल्य 55-65°C आहे (कारण exonuclease क्रियाकलाप 60°C वर सर्वाधिक आहे), आणि GC सामग्री 40%-60% आहे.
3. ब्‍लास्‍ट: जीनोमचे गैर-विशिष्ट प्रवर्धन टाळण्यासाठी, ब्‍लास्‍टचा वापर पूरक पडताळणीसाठी करणे आवश्‍यक आहे.

MIQE(7)-qPCR प्रक्रिया

1. qPCR किट
MIQE च्या आवश्यकतांनुसार, आम्ही लेखातील संपूर्ण प्रतिक्रिया परिस्थितीचे स्पष्टपणे वर्णन केले पाहिजे, ज्यामध्ये PCR प्रतिक्रिया प्रणालीचे कॉन्फिगरेशन, कोणते किट वापरले जाते, निर्माता कोण आहे, प्रतिक्रिया प्रणाली किती मोठी आहे, डाई पद्धत किंवा प्रोब पद्धत वापरली जाते की नाही, PCR प्रोग्राम सेटिंग्ज.अनुभवी ड्रायव्हर्सना निश्चितपणे आढळेल की जोपर्यंत किट निवडले जाते, वरील माहिती मुळात निर्धारित केली जाते.
सध्या, फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक पीसीआर किटचे उत्पादन आणि उत्पादन हे एक अतिशय परिपक्व तंत्रज्ञान आहे.जोपर्यंत तुम्ही अत्यंत वाईट उत्पादक निवडत नाही तोपर्यंत, समस्यांची शक्यता जास्त नसते, परंतु तरीही आम्ही तुमच्यासोबत काही मुद्दे सामायिक करू इच्छितो:
हॉट-स्टार्ट Taq एन्झाइम:पीसीआरचा सर्वात महत्त्वाचा भाग म्हणजे हॉट-स्टार्ट टाक एन्झाइम.बाजारातील हॉट-स्टार्ट एन्झाइम्स साधारणपणे दोन प्रकारांमध्ये विभागले जातात, एक रासायनिकदृष्ट्या सुधारित हॉट-स्टार्ट एन्झाईम आहे (आपण पॅराफिन एम्बेडिंग म्हणून त्याची कल्पना करू शकता), आणि दुसरे म्हणजे अँटीबॉडी सुधारण्यासाठी हॉट-स्टार्ट एन्झाइम आहे (अँटीजन-अँटीबॉडी बंधनकारक).रासायनिक बदल हा गरम-सुरू होणार्‍या एन्झाईमचा प्रारंभिक मार्ग आहे.जेव्हा विशिष्ट तापमान गाठले जाते, तेव्हा एंजाइम त्याची क्रिया सोडते.अँटिबॉडी-सुधारित हॉट-स्टार्ट एन्झाइम एंझाइमची क्रिया रोखण्यासाठी जैविक पद्धती वापरते.जेव्हा विशिष्ट तापमान गाठले जाते, तेव्हा प्रतिपिंड विकृत केले जाईल आणि प्रथिने म्हणून निष्क्रिय केले जाईल आणि एन्झाईमची क्रिया कार्यात आणली जाईल.

मात्र, याचा उपयोग काय?हे असे आहे की, ऍन्टीबॉडी-सुधारित एन्झाईम्सची रिलीझ क्रिया रासायनिक सुधारित एन्झाईम्सपेक्षा वेगवान असते, त्यामुळे संवेदनशीलतेच्या बाबतीत, ऍन्टीबॉडी-सुधारित एन्झाईम्सचा थोडा फायदा असतो, ज्यामुळे बाजारात किटमध्ये मुळात कोणतेही रासायनिक सुधारित एन्झाइम नाहीत.जर असेल तर, हे निर्मात्याचे तंत्रज्ञान अजूनही सहस्राब्दीच्या युगात अडकले आहे.
मॅग्नेशियम आयन एकाग्रता:PCR प्रतिक्रिया मध्ये मॅग्नेशियम आयन एकाग्रता खूप महत्वाचे आहे.योग्य मॅग्नेशियम आयन एकाग्रता Taq एन्झाइम क्रियाकलाप सोडण्यास प्रोत्साहन देऊ शकते.एकाग्रता खूप कमी असल्यास, एंजाइमची क्रिया लक्षणीयरीत्या कमी होईल;एकाग्रता खूप जास्त असल्यास, एंजाइम-उत्प्रेरित नॉन-विशिष्ट प्रवर्धन वर्धित केले जाईल.मॅग्नेशियम आयनच्या एकाग्रतेचा प्राइमर्सच्या एनीलिंगवर, टेम्पलेटचे वितळण्याचे तापमान आणि पीसीआर उत्पादनांवर देखील परिणाम होतो, ज्यामुळे वाढीव तुकड्यांच्या उत्पन्नावर परिणाम होतो.मॅग्नेशियम आयनची एकाग्रता सामान्यतः 25mM वर नियंत्रित केली जाते.अर्थात, चांगल्या किटसाठी, मॅग्नेशियम आयनची एकाग्रता चांगल्या प्रकारे नियंत्रित करणे आवश्यक आहे.काही व्यापारी अभिकर्मकामध्ये मॅग्नेशियम आयन चेलेटिंग एजंट जोडतात, जे मॅग्नेशियम आयन एकाग्रतेच्या स्वयंचलित समायोजनाचा प्रभाव प्राप्त करू शकतात.
फ्लोरोसेंट डाई एकाग्रता:फ्लूरोसंट डाई, जो SYBR ग्रीन आहे जो आपण सहसा वापरतो, मुख्यतः डबल-स्ट्रॅन्ड डीएनएच्या किरकोळ खोबणीला बांधून फ्लूरोसेन्स तयार करतो, कारण डाईचे डबल-स्ट्रँडेड DNA ला बांधणे विशिष्ट नसते, म्हणजेच जोपर्यंत डबल-स्ट्रँडेड DNA असतो, तोपर्यंत ते DNA मध्ये फ्लूरोसेन्स आणि प्राइम-स्ट्रॅन्डेड डीएनए एकत्र केले जाते. पार्श्वभूमी सिग्नल तयार करण्यासाठी सिस्टम त्याच्याशी एकत्रित होईल.
PS: त्याच्या प्रकाश-संवेदनशील गुणधर्मांमुळे, बाजारात उत्पादने सामान्यतः तपकिरी अपारदर्शक सेंट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये पॅक केली जातात (खालील चित्रात दर्शविल्याप्रमाणे).तथापि, यामुळे एक समस्या येईल.सॅम्पलिंग करताना द्रव शोषला जातो की नाही हे पाहणे कठीण आहे.या संदर्भात, किंगके खरोखरच सर्वात वापरकर्ता-अनुकूल आहे (खालील चित्रात दर्शविल्याप्रमाणे), आणि पारदर्शक ट्यूब एका अपारदर्शक टिन बॅगमध्ये पॅक केली जाते.नंतर प्रकाश आणि सॅम्पलिंग टाळण्याची सोय लक्षात घेऊन टिनच्या पिशवीत ठेवा.तुम्ही योग्य उत्पादन क्रमांक निवडणे आवश्यक आहे.TSE204 हे अत्यंत किफायतशीर अस्तित्व आहे, ज्यामुळे मला गवत लावायचे आहे.

फ्लोरोसेंट डाईची एकाग्रता देखील खूप महत्वाची आहे.एकाग्रता खूप कमी असल्यास, प्रवर्धन वक्र नंतरच्या टप्प्यात वर जाणार नाही आणि परिपूर्ण नाही;जर एकाग्रता खूप जास्त असेल, तर ते आवाज हस्तक्षेप करेल.फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक पीसीआर मुख्यत्वे सीटी मूल्यावर अवलंबून असल्याने, जर फ्लोरोसेंट डाईची एकाग्रता योग्यरित्या समायोजित केली नाही, तर कमी बिंदू उच्च बिंदूपेक्षा चांगला असतो.अर्थात, योग्य डाई एकाग्रता सर्वोत्तम आहे.

आरओएक्स: ROX रंगांचा वापर वेल-टू-वेल फ्लोरोसेन्स सिग्नलच्या चुका सुधारण्यासाठी केला जातो.काही इन्स्ट्रुमेंट उत्पादकांना कॅलिब्रेशनची आवश्यकता असते, तर काहींना नाही.उदाहरणार्थ, थर्मो फिशर सायंटिफिकच्या रिअल टाइम पीसीआर अॅम्प्लीफिकेशन इन्स्ट्रुमेंटच्या वापरासाठी साधारणत: 7300, 7500, 7500फास्ट, स्टेपवनप्लस इत्यादीसह कॅलिब्रेशन आवश्यक आहे. सामान्य किट सूचना त्याचे वर्णन करतील.
Foregene च्या qPCR मिक्समध्ये ROX डाई देखील आहे, जे विविध मॉडेल्समध्ये वापरण्यासाठी सोयीचे आहे.

रिअल टाइम पीसीआर किट-ताकमान

कमकुवत हायड्रोजन बाँड उपचार: कमकुवत हायड्रोजन बंधांवर उपचार करणे ही तुलनेने तांत्रिक बाब आहे.अनेक किट्सचे मॅन्युअल काहीही वाचले नाही, परंतु त्यापैकी कोणीही या विषयाचा उल्लेख केला नाही.खरं तर, ते खूप महत्वाचे आहे.बेसचे संयोजन प्रामुख्याने हायड्रोजन बाँडच्या ताकदीवर अवलंबून असते.सशक्त हायड्रोजन बंध हे सामान्य प्रवर्धन असतात आणि कमकुवत हायड्रोजन बंध विशिष्ट नसलेल्या प्रवर्धनास कारणीभूत ठरतात.जर कमकुवत हायड्रोजन बंध चांगल्या प्रकारे काढून टाकले जाऊ शकत नाहीत, तर विशिष्ट नसलेले प्रवर्धन टाळता येत नाही.लेखकाच्या कार्यक्षेत्रात, केवळ काही कंपन्यांनी ही समस्या लक्षात घेतली आहे.तुम्ही किट खरेदी करता तेव्हा, तुम्ही निवडू इच्छित असलेल्या किटसाठी तुम्ही या संदर्भात उपाय विचारात घेतला आहे का याचा संदर्भ घेऊ शकता.

प्रतिक्रिया खंड: 20-50ul प्रणाली अधिक सामान्यपणे वापरली जाते आणि लहान खंडांमुळे त्रुटी निर्माण होण्याची शक्यता असते.सर्वसाधारणपणे, किट सूचना पीसीआर प्रतिक्रिया खंड वापरण्याची शिफारस करेल.हुशार होऊ नका आणि खर्च वाचवण्यासाठी लहान व्हॉल्यूम वापरा.चे ध्येय.व्यापाऱ्यांनी शिफारस केलेल्या व्हॉल्यूमची प्रत्यक्षात चाचणी केली गेली आहे आणि असे होऊ शकते की ते लहान खंडांमुळे झालेल्या त्रुटींची समस्या सोडवू शकत नाहीत.
2. ट्यूब प्लेटचा निर्माता आणि लेख क्रमांक
फ्लोरोसेंट परिमाणवाचक पीसीआरचे तत्त्व प्रत्येकाला माहीत आहे.फ्लोरोसेन्स संकलन प्रामुख्याने पीसीआर ट्यूब कॅप्सद्वारे केले जाते.पीसीआर उपभोग्य वस्तू निवडताना, दोन मुद्द्यांकडे लक्ष द्या: चांगले प्रकाश प्रसारण आणि इन्स्ट्रुमेंटसाठी योग्य.सर्वसाधारणपणे, मुख्य प्रवाहातील ब्रँडचे बोर्ड आणि नळ्या ठीक आहेत, परंतु आपल्याला अनुकूलतेच्या दृष्टीने काळजीपूर्वक निवडावे लागेल, अन्यथा आपण इन्स्ट्रुमेंट वापरण्यास सक्षम राहणार नाही.

4. उच्च पातळीचे ज्ञान

MIQE (8)-qPCR प्रमाणीकरण
qPCR ची ही सर्वोच्च प्राथमिकता आहे!त्यामुळे अनेक वीर येथे वाळूत पडले आहेत.अर्थात, हे देखील शक्य आहे की तुम्ही भाग्यवान आहात आणि तुम्ही अभ्यास केलेले जीन्स सोपे आहेत, म्हणून तुम्ही बर्फाच्या गुहेतून वार्‍यावर तरंगला आहात.qPCR ची पडताळणी माहिती डेटाची विश्वासार्हता तपासण्यासाठी आहे.आम्ही आवश्यक सत्यापन माहिती खालीलप्रमाणे सूचीबद्ध करतो:

1.विशिष्टता चाचणी
इलेक्ट्रोफोरेसीस चित्र एकल बँड आहे की नाही हे तपासून लक्ष्य जनुक प्रवर्धनाची विशिष्टता तपासली जाते;अनुक्रम सत्यापन;शिखर नकाशा एकल आहे की नाही हे पाहण्यासाठी वितळणे वक्र;एंजाइम पचन सत्यापन आणि इतर पद्धती.
येथे, आम्ही टी वर लक्ष केंद्रित करतोवक्र वितळण्याच्या पद्धतीचा वापर करून विशिष्ट नसलेल्या प्रवर्धनाचे विश्लेषण.सर्वसाधारणपणे, जेव्हा आपण प्राइमर्स डिझाइन करतो तेव्हा उत्पादनाच्या तुकड्याचा आकार 80-200bp च्या श्रेणीत असणे आवश्यक आहे, ज्यामुळे PCR उत्पादनाचे वितळण्याचे तापमान 80-85 °C श्रेणीत होते.म्हणून, जर विविध शिखरे असतील तर, इतर गैर-विशिष्ट प्रवर्धन उत्पादने असणे आवश्यक आहे;जर शिखर 80°C च्या खाली दिसले, तर ते सामान्यतः प्राइमर डायमर मानले जाते;जर शिखर 85 डिग्री सेल्सिअसच्या वर दिसले, तर ते सामान्यतः डीएनए दूषित किंवा मोठ्या तुकड्यांचे अधिक गैर-विशिष्ट प्रवर्धन मानले जाते.
टीप: काहीवेळा 80°C वर फक्त एकच शिखर असते.यावेळी, या संकल्पनेचे पालन करणे आवश्यक आहे.प्रवर्धन परिणाम सर्व प्राइमर डायमर असण्याची शक्यता आहे.

सामान्य वितळण्याची वक्र (कोणतेही विशिष्ट प्रवर्धन नसलेले एकल शिखर)

समस्याप्रधान वितळणे वक्र (नसलेल्या शिखरांचे गैर-विशिष्ट प्रवर्धन)
【केस विश्लेषण】

एक मुख्य शिखर आहे, परंतु प्राइमर डायमर गंभीर आहे
खालील आकृतीतील सिंगल-पीक मेल्टिंग वक्र आपल्या डोळ्यांना सहज फसवू शकते, हा एक परिपूर्ण प्रयोग आहे असे समजून, परंतु परिणाम पूर्णपणे चुकीचा आहे.यावेळी, आपल्याला वितळण्याचे तापमान पहावे लागेल.कमाल तापमान 80°C च्या खाली आहे, जे पूर्णपणे प्राइमर-डायमर आहे.

कोणतेही लक्ष्य तुकडा नाही, सर्व प्राइमर डायमर
इथे माझा भाऊ थांबू शकत नाही.खाली दिलेला फोटो मोबाईल फोनने काढलेला फोटो आहे जो मला एका स्कंबॅगने पाठवला आहे.त्याने वापरलेले अभिकर्मक उद्योगातील सर्व सामान्यपणे वापरले जाणारे ब्रँड आहेत.तो एका टी-प्रीफिक्स ब्रँडमधून दुसऱ्या टी-प्रीफिक्स ब्रँडमध्ये बदलला.मला वाटते तुम्ही आधीच अंदाज लावला असेल.स्कंबॅग मला ओरडला: “पहिल्या चित्रात वापरलेला अभिकर्मक खूप चांगला आहे आणि शिखर सिंगल आहे.नंतर, आपण शिफारस केलेले अभिकर्मक वापरल्यानंतर, ते मिश्रित शिखरांसह दुसऱ्या चित्रासारखे बनते.तू मला दुःखी केलेस."
दोन आलेख वेगळे करा.पहिल्या दृष्टीक्षेपात, एकाला एकच शिखर आहे आणि दुसर्‍याला दुहेरी शिखर आहे.मूर्खपणा, एकच शिखर अर्थातच ठीक आहे.ते खरं आहे का?
Dou E पेक्षा वाईट, जर मी खालील चित्रात दोन चित्रे टाकली तर तुम्हाला लगेच समजेल.किंबहुना या प्रकारच्या चित्रामुळे आपण सहज स्तब्ध होतो.काळजीपूर्वक विश्लेषण केल्यानंतर, आम्हाला आढळले की: पहिल्या आकृतीचे शिखर 75°C आहे, जे पूर्णपणे प्राइमर डायमर आहे;दुसऱ्या आकृतीचे शिखर 75°C आणि 82°C वर दिसते, किमान तेथे उत्पादन दिसून येते.

विद्यार्थ्यांच्या अभिप्रायाची चित्रे
त्यामुळे मूलभूत समस्या अभिकर्मकांची समस्या नसून प्राइमर डिझाइनची समस्या आहे.त्याच वेळी, हे देखील सिद्ध होते की काही मोठे ब्रँड लोह दर्जाचे नाहीत आणि हे देखील सिद्ध करते की माझ्या भावाने आधी काय म्हटले आहे: हे अभिकर्मक ब्रँड नाही जे तुमच्या लेखाचे समर्थन करते.हा तुमचा लेख आहे ज्याने अभिकर्मकांचा ब्रँड तयार केला आहे.जरा कल्पना करा, जर स्कंबॅगने अभिकर्मक बदलले नाहीत तर चुकीचा डेटा जर्नलला पाठवला जाईल आणि काय होईल ही एक शोकांतिका असेल.
2. रिक्त नियंत्रणाचे Ct मूल्य
समजावून सांगू नका, रिकाम्या कंट्रोलला Ct व्हॅल्यू असेल तर ते प्रदूषण नाही का?तथापि, आपल्याला अद्याप हे समजून घेणे आवश्यक आहे की कोणत्या रिक्त नियंत्रणामध्ये Ct मूल्य आहे.जर ते एनटीसी असेल, तर याचा अर्थ असा की तेथे विदेशी डीएनए आहे जसे की अभिकर्मक दूषित होणे.जर ते एनआरटी असेल, तर याचा अर्थ काढलेल्या आरएनएमध्ये डीएनए दूषित आहे.
3. मानक वक्र
उतार आणि गणना सूत्रासह, पीसीआर कार्यक्षमता सूत्राद्वारे मोजली जाऊ शकते.एका परिपूर्ण प्रयोगासाठी 3.32 पर्यंत जाण्यासाठी मानक वक्रचा उतार आणि 0.9999 पर्यंत पोहोचण्यासाठी R² आवश्यक आहे.
4. रेखीय डायनॅमिक श्रेणी
प्रतिक्रियेची डायनॅमिक श्रेणी रेखीय आहे.मानक वक्र तयार करण्यासाठी वापरल्या जाणार्‍या टेम्पलेटनुसार, डायनॅमिक श्रेणीमध्ये कमीत कमी 5 एकाग्रता ग्रेडियंटचा समावेश असावा आणि उच्च एकाग्रता ग्रेडियंट्स आणि कमी एकाग्रता ग्रेडियंटमध्ये Ct मूल्यांच्या बदलाकडे लक्ष द्या.
5. शोध अचूकता
qPCR परिणामांमधील बदल, म्हणजे, खराब पुनरावृत्तीक्षमता, म्हणजेच खराब अचूकता, तापमान, एकाग्रता आणि ऑपरेशनसह अनेक घटकांमुळे होतात.कॉपी संख्या कमी झाल्यामुळे qPCR अचूकता सामान्यतः कमी नियंत्रणीय बनते.तद्वतच प्रायोगिक भिन्नता अंतर्गत, ही तांत्रिक भिन्नता जैविक भिन्नतेपेक्षा वेगळी असावी आणि जैविक प्रतिकृती गट किंवा उपचारांमधील qPCR परिणामांमधील सांख्यिकीय फरकांना थेट संबोधित करू शकतात.विशेषतः डायग्नोस्टिक असेससाठी, साइट्स आणि ऑपरेटर्सवर सर्वोत्कृष्ट आंतर-परीक्षण अचूकता (पुनरावृत्तीयोग्यता) नोंदवणे आवश्यक आहे.
6. शोध कार्यक्षमता आणि LOD (मल्टिप्लेक्स qPCR मध्ये)
आढळलेल्या पॉझिटिव्ह नमुन्यांपैकी 95% मध्ये LOD ही सर्वात कमी एकाग्रता आहे.दुसऱ्या शब्दांत, लक्ष्यित जनुकांच्या प्रतिकृतींच्या संचामध्ये असलेल्या एलओडीची एकाग्रता अयशस्वी प्रतिक्रियांच्या 5% पेक्षा जास्त नसावी.मल्टिप्लेक्स qPCR विश्लेषण करताना, विशेषत: पॉइंट म्युटेशन्स किंवा पॉलीमॉर्फिझम्सच्या एकाचवेळी शोधण्यासाठी, मल्टीप्लेक्स qPCR ला पुरावे प्रदान करणे आवश्यक आहे की एकाच ट्यूबमध्ये एकाधिक लक्ष्य तुकड्यांच्या अचूकतेशी तडजोड केली जात नाही, एकाधिक शोध आणि सिंगल ट्यूब डिटेक्शन कार्यक्षमता आणि LOD समान असावे.विशेषत: जेव्हा उच्च-एकाग्रता लक्ष्य जीन्स आणि कमी-एकाग्रतेचे लक्ष्य जनुक एकाच वेळी वाढवले ​​जातात, तेव्हा या समस्येकडे लक्ष देणे आवश्यक आहे.
समस्या आणि उपायसर्वसाधारणपणे, qPCR डीबगिंगमध्ये अनेकदा येणाऱ्या समस्या खालील पैलूंवर लक्ष केंद्रित करतात:
· अविशिष्ट प्रवर्धन
प्राइमर एकाग्रतेची अवघड निवड आणि प्राइमर-डायमरसह समस्या
· एनीलिंग तापमान चुकीचे आहे
दुय्यम संरचना प्रवर्धन कार्यक्षमतेवर परिणाम करते
अविशिष्ट प्रवर्धन
गैर-विशिष्ट प्रवर्धनउद्भवते, सामान्यतः प्राइमर डिझाइन योग्य नाही की नाही याचा विचार केला जातो, परंतु जर तुम्हाला प्राइमर्स बदलण्याची घाई नसेल, तर तुम्ही प्रथम खालील पद्धती वापरून पाहू शकता (तत्त्व देखील जोडलेले आहे):
· एनीलिंग तापमान वाढवा - कमकुवत हायड्रोजन बंध कायम ठेवण्यास अक्षम बनवण्याचा प्रयत्न करा;
· एनीलिंग आणि वाढवण्याची वेळ कमी करा - कमकुवत हायड्रोजन बंधांची शक्यता कमी करा;
· प्राइमर एकाग्रता कमी करा - अनावश्यक प्राइमर्स आणि लक्ष्य नसलेल्या प्रदेशांच्या बंधनाची शक्यता कमी करा;
कमी प्रवर्धन कार्यक्षमता
गैर-विशिष्ट प्रवर्धनासाठी विरुद्ध परिस्थिती - कमी प्रवर्धन कार्यक्षमता आणि कमी प्रवर्धन कार्यक्षमतेला सामोरे जाण्यासाठीचे उपाय अगदी उलट आहेत:
· एनीलिंग आणि वाढवण्याची वेळ वाढवा;
· तीन-चरण पीसीआरमध्ये बदला आणि अॅनिलिंग तापमान कमी करा;
प्राइमर एकाग्रता वाढवा;
Ps: 90 च्या दशकात जन्मलेले अनेक पदवीधर विद्यार्थी प्रयोग कसे डीबग करायचे याचा अभ्यास करण्यास तयार नसतात आणि आशा करतात की किट समस्येचे पूर्णपणे निराकरण करेल (जर तुम्हाला पदवीनंतर संशोधन आणि विकास करण्यासाठी अभिकर्मक कंपनीकडे जायचे असेल तर), खरं तर, अभिकर्मक उत्पादक देखील असाच विचार करतात, मला आशा आहे की जेव्हा तुम्हाला ते मिळेल तेव्हा ते वापरता येईल, त्यामुळे निर्मात्यांच्या समस्या सोडवण्यासाठी मोठ्या प्रमाणात प्रयत्न केले जातील. कमकुवत एच-बॉन्ड शोषण घटकांचा परिचय.समस्येचे सहज निराकरण करण्यासाठी, कमकुवत हायड्रोजन बंध शोषून घेणारा घटक आहे की नाही हे पाहण्यासाठी मूर्खांना अभिकर्मक कंपनीचा परिचय वाचावा लागेल.
प्राइमर एकाग्रतेची अवघड निवड आणि प्राइमर-डायमरसह समस्या
पद्धत 1: साधारणपणे सांगायचे तर, qPCR साठी किट सूचनांमध्ये सिस्टीमची शिफारस केली आहे आणि प्राइमर एकाग्रतेची शिफारस केली आहे.
पद्धत 2: प्राइमर एकाग्रता ग्रेडियंट सेट करून डीबग करणे.स्पष्ट करण्यासाठी खालील चित्र एका कंपनीतून चोरले आहे.खालील आकृती तीन प्राइमर एकाग्रता ग्रेडियंट (100nM, 250nM, 500nM) आणि चार टेम्प्लेट एकाग्रता ग्रेडियंट (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng) सह बनवलेले फ्लोरोसेन्स परिमाणात्मक परिणाम दर्शविते.प्रायोगिक परिणामांचे Ct मूल्य खालीलप्रमाणे प्लॉट केले आहे:

प्राइमर एकाग्रता निवड खालीलप्रमाणे प्रत्येक प्राइमर एकाग्रता एका ओळीत एकत्र करा:

प्राइमर एकाग्रतेची निवड स्पष्ट आहे, 100nM आणि 250nM च्या प्राइमर एकाग्रतेचा रेखीय संबंध अधिक चांगला आहे आणि 500nM च्या प्राइमर एकाग्रतेचा रेखीय संबंध तुलनेने खराब आहे.100nM आणि 250nM मध्ये, 250nM चे Ct मूल्य तुलनेने लहान आहे, म्हणून इष्टतम प्राइमर एकाग्रता 250nM आहे.सामान्यतः गंभीर प्राइमर-डायमर वितळण्याच्या वक्र मध्ये दिसू शकतात.डिझाइन केलेले प्राइमर्स प्राइमर-डायमर टाळू शकत नसल्यास काय?
पद्धत 3: प्राइमर्सचे प्रमाण कमी करा आणि अॅनिलिंग तापमान वाढवा (स्पष्टीकरण करण्याची गरज नाही).
अॅनिलिंग तापमानाचे प्रायोगिक मूल्य 60°C आहे.आपल्याला खात्री नसल्यास, अधिक योग्य अॅनिलिंग तापमान कसे निवडायचे?उत्तर प्राइमर एकाग्रतेच्या निवडीसारखेच आहे -ग्रेडियंट चाचणी.समस्या स्पष्ट करण्यासाठी Bio-rad कंपनीकडून एक चित्र घ्या.विशिष्ट लक्ष्य तुकड्याच्या प्रवर्धनासाठी, आठ तापमान ग्रेडियंट सेट करा, प्रत्येक तीन पुनरावृत्तीसह, आणि प्राप्त केलेले प्रवर्धन वक्र खालीलप्रमाणे आहे:

एनीलिंग तापमान निवड:
·70°C, 69°C—मुळात, प्राइमर्स एकत्र करता येत नाहीत, त्यामुळे कोणतेही प्रवर्धन होत नाही.
· 67.3°C - सुरुवातीला थोड्या प्रमाणात प्रवर्धन आहे आणि Ct मूल्य तुलनेने मोठे आहे.
· 64.5°C——Ct मूल्य कमी होते.
· 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, आणि 55.0°C वर, Ct मूल्ये मुळात स्थिर होती, परंतु अंतिम प्रतिदीप्ति मूल्ये भिन्न होती.
कसे निवडायचे?तत्त्व: पहिले तत्त्व उच्च Ct मूल्य आहे.समान Ct मूल्यासाठी, डायमरायझेशन आणि गैर-विशिष्ट प्रवर्धन टाळण्यासाठी उच्च अॅनिलिंग तापमान निवडा.55°C वर उच्च प्रतिदीप्ति मूल्य असले तरी, त्यात डायमर किंवा विशिष्ट नसलेले प्रवर्धन असू शकते.
परंतु जर तुम्ही तुमच्यासारखे हुशार असाल, तर तुम्ही नक्कीच विचार कराल: तार्किकदृष्ट्या, जर पीसीआर प्रतिक्रिया अतिशय विशिष्ट असेल, जोपर्यंत प्राइमर एकाग्रता किमान आवश्यकतेपेक्षा जास्त असेल, तर फ्लोरोसेंट रंग आणि डीएनटीपी प्रमाणेच उच्च आणि निम्न बिंदूंवर कोणताही परिणाम होऊ नये.खरंच, जोपर्यंत अॅनिलिंग तापमान योग्यरित्या ऑप्टिमाइझ केले जाते, तोपर्यंत Ct मूल्यावरील प्राइमर एकाग्रतेचा प्रभाव नैसर्गिकरित्या कमी केला जाईल.

अॅनिलिंग तापमान योग्यरित्या ऑप्टिमाइझ केले आहे आणि सीटीवरील प्राइमर एकाग्रतेचा प्रभाव कमी केला जाईल
दुय्यम संरचना प्रवर्धन कार्यक्षमतेवर परिणाम करते
समस्या स्पष्ट करण्यासाठी Bio-rad वरून चित्र घेऊ.ते दुय्यम संरचनेसह जनुक वाढवण्यासाठी तापमान ग्रेडियंट देखील डिझाइन करते.

दुय्यम रचना उदयास येते
हे पाहिले जाऊ शकते की जसजसे तापमान ग्रेडियंट कमी होते, उत्पादने दिसू लागतात आणि Ct मूल्य पुढे सरकते, किमान मूल्य 60.7°C वर पोहोचते आणि नंतर तापमान ग्रेडियंट कमी होताना, Ct मूल्य मोठे होते.याउलट, जसजसे तापमान वाढते, दुय्यम संरचना उघडते आणि प्रवर्धन कार्यक्षमता वाढते.विशिष्ट तापमानापर्यंत पोहोचल्यानंतर, तापमान वाढल्याने प्रवर्धन कार्यक्षमता सुधारू शकत नाही.कारण यावेळी प्राइमर्स स्थिरपणे एकत्र करता येत नाहीत.त्यामुळे,सर्वात कमी Ct मूल्य असलेले तापमान पहा, जे दुय्यम संरचना टेम्प्लेट वाढवण्यासाठी सर्वोत्तम तापमान आहे!अर्थात, स्मार्ट मूर्खांना हे माहित असणे आवश्यक आहे की जर ते आवश्यक नसेल तर, प्राइमर बदलणे आणि दुय्यम संरचना क्षेत्र टाळणे चांगले आहे.
5. अर्ज पातळी
MIQE - डेटा विश्लेषण

डेटा विश्लेषण मुख्यत्वे फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक पीसीआर उपकरणाद्वारे दिले जाते.मागील लेखात, डेटा विश्लेषणाचे बरेच काम केले गेले आहे, जसे की रिक्त नियंत्रण, जे प्रयोगाच्या डिझाइनमध्ये स्पष्ट केले आहे.अंतर्गत संदर्भ जनुक, पुनरावृत्ती संख्या इत्यादी स्पष्ट केले आहेत., येथे आम्ही प्रामुख्याने qPCR च्या अनुप्रयोगाचे स्पष्टीकरण देतो.
qPCR चा मोठ्या प्रमाणावर वापर केला जातो आणि प्रायोगिक पडताळणी आणि न्यूक्लिक अॅसिड निदान ही सर्वात सामान्यपणे वापरली जाणारी परिस्थिती आहे.
परिपूर्ण परिमाण
लॉग (प्रारंभिक एकाग्रता) चा चक्रांच्या संख्येशी एक रेखीय संबंध आहे.ज्ञात प्रारंभिक प्रत क्रमांकासह मानकावरून एक मानक वक्र काढला जाऊ शकतो, म्हणजे, प्रवर्धन प्रतिक्रियेचा रेखीय संबंध मिळवता येतो.नमुन्याच्या Ct मूल्यानुसार, नमुन्यातील एकाग्रतेची गणना केली जाऊ शकते.समाविष्ट करण्यासाठी टेम्पलेट्सचे प्रमाण.

परिपूर्ण परिमाणात्मक गणना पद्धत
परिपूर्ण परिमाण प्रमाणित वक्र वर आधारित असणे आवश्यक आहे.मानक वक्र करण्यासाठी, एक मानक आवश्यक आहे.सामान्यतः, मानक हे लक्ष्यित जनुकाचे क्लोनिंग करून प्राप्त केलेले प्लाझमिड असते.हे प्लाझमिड का आहे?कारण वर्तुळाकार प्लास्मिड डीएनए सर्वात स्थिर असतो.दुप्पट प्रमाणानुसार (10-पट पातळ करणे) 5 ते 6 ग्रेडियंटमध्ये मानक उत्पादन पातळ करा आणि पातळ करताना एकसमानतेकडे लक्ष द्या.Ct मूल्य 15-30 च्या दरम्यान येऊ द्या.

मानक तयारी
त्याच वेळी, चाचणी करावयाचा नमुना देखील त्यानुसार पातळ केला गेला पाहिजे (विघटन घटक लक्षात ठेवा), आणि Ct मूल्य देखील 15-30 च्या दरम्यान असावे.प्रमाणित उत्पादन + चाचणीसाठी नमुना एकत्र मशीनवर ठेवला जातो.धावल्यानंतर, प्रमाणित पदार्थासह एक मानक वक्र बनविला गेला आणि एकाग्रतेची गणना करण्यासाठी चाचणीसाठी नमुने मानक वक्रमध्ये आणले गेले.
हिपॅटायटीस बी विषाणू एचबीव्ही प्रमाणीकरण हे एक विशिष्ट परिपूर्ण परिमाण आहे, जे 1 मिली रक्तामध्ये विषाणूची कॉपी संख्या मोजू शकते.
कॉपी नंबरची गणना
चाचणी केली जाणारी नमुना एकाग्रता (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × dilution factor
नमुना आण्विक वजन = पायाची संख्या × 324
चाचणी करायच्या नमुन्याची प्रत क्रमांक (कॉपी/उल) = चाचणी करायच्या नमुन्याची एकाग्रता / नमुन्याचे आण्विक वजन × 6 × 1014

कॉपी नंबरची गणना पद्धत

वरील प्रमाण निश्चित करण्यासाठी गणना पद्धत आहे.ही एक गणितीय समस्या आहे जी कनिष्ठ माध्यमिक शाळेतून पदवी घेतल्यानंतर सोडवली जाऊ शकते आणि गणिताच्या समस्या सामान्यतः संगणकाद्वारे सोडवल्या जातात.तुम्हाला समजत नसेल, तर तुम्ही संवाद साधण्यासाठी येऊ शकता.
सापेक्ष परिमाण
सापेक्ष प्रमाणीकरण प्रामुख्याने वैज्ञानिक संशोधनात वापरले जाते.1ml रक्तामध्ये किती विषाणू आहेत आणि तो DNA व्हायरस आहे, ही एक तुलनेने निर्धारक घटना आहे: रक्ताचे प्रमाण निश्चित केले जाऊ शकते आणि DNA विषाणू तुलनेने स्थिर आहे.तथापि, पानातील विशिष्ट जनुकाच्या ट्रान्सक्रिप्शन प्रतींच्या संख्येची तुलना करणे आपल्यासाठी अवघड आहे, कारण पानाचा आकार, वजन आणि कोमलता निश्चित करणे कठीण आहे, काढलेल्या आरएनएचे प्रमाण निश्चित करणे कठीण आहे आणि रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनची कार्यक्षमता देखील निर्धारित करणे कठीण आहे, म्हणजेच कोणत्याही चरणामुळे प्रायोगिक डेटा वापरला जाऊ शकत नाही.
म्हणून, सापेक्ष परिमाणात एक घटक सादर करणे आवश्यक आहे:अंतर्गत संदर्भ जनुक.
दुस-या शब्दात सांगायचे तर, सापेक्ष प्रमाणीकरण ही प्रत्यक्षात लक्ष्य जनुक आणि अंतर्गत संदर्भ जनुक यांच्यातील तुलना आहे.समान ऊतक आणि समान पेशींच्या तुलनेत, नमुना आकाराचा प्रभाव, आरएनए निष्कर्षण रक्कम, उलट प्रतिलेखन कार्यक्षमता आणि PCR कार्यक्षमता तुलनेने कमी आहे.लहान नमुना आकारामुळे, अंतर्गत संदर्भ जीन्स आणि लक्ष्य जीन्स दोन्ही तुलनेने कमी झाले.म्हणूनच आम्ही पूर्वी एकसमानता आणि स्थिरतेवर भर देत आलो आहोत.
अंतर्गत संदर्भ जीन्स सामान्यतः असतातहाउसकीपिंग जीन्स( हाऊस-कीपिंग जीन्स), जे सर्व पेशींमध्ये स्थिरपणे व्यक्त केलेल्या जनुकांच्या वर्गाचा संदर्भ देतात आणि त्यांची उत्पादने पेशींच्या मूलभूत जीवन क्रियाकलाप राखण्यासाठी आवश्यक असतात.
ही संकल्पना गोंधळात टाकू नका.हाउसकीपिंग जीन्स हे जैविक कार्य संज्ञा आहेत, तर अंतर्गत संदर्भ जीन्स प्रायोगिक तांत्रिक संज्ञा आहेत.हाऊसकीपिंग जीन्सची अंतर्गत संदर्भ जीन्स म्हणून निवड करण्यापूर्वी त्यांना प्रमाणीकरण पास करणे आवश्यक आहे.
उदाहरणार्थ, आम्‍ही खालील आकृतीमध्‍ये अनेक हाऊसकीपिंग जनुके निवडले आहेत जेव्‍हा वेगवेगळ्या ऊतक पेशींमधील अभिव्‍यक्‍ती स्‍तरांची चाचणी करण्‍यासाठी आणि β-2-मायक्रोग्लोबुलिनची अभिव्‍यक्‍ती पातळी इतर तीन जनुकांपेक्षा अगदी वेगळी होती, त्यामुळे ते अंतर्गत संदर्भ जनुकांमध्‍ये वापरले जाऊ शकत नाहीत.

अंतर्गत संदर्भ जनुकाच्या सुधारणेचे कार्य समजून घेतल्यानंतर, अंतर्गत संदर्भ जनुकाच्या परिचयामुळे दोन अल्गोरिदम प्राप्त होतात.
· दुहेरी मानक वक्र पद्धत
·2 – △△Ct पद्धत (CT मूल्य तुलना पद्धत)
तुम्हाला प्रजाती आणि जनुकांच्या कार्यांचा अभ्यास करण्यात स्वारस्य असल्यास, कृपया अल्गोरिदमवरील संशोधन सोडून द्या आणि थेट सूत्रे वापरा किंवा थेट मशीन वापरा;जर तुम्ही गणित आणि अभियांत्रिकीमध्ये सरळ माणूस असाल तर कृपया मोकळे व्हा.
दुहेरी मानक वक्र पद्धत
नियंत्रण नमुन्याचे लक्ष्य जनुक आणि हाऊसकीपिंग जनुक आणि मानक वक्र द्वारे तपासल्या जाणार्‍या नमुन्याचे प्रमाण निश्चित करा आणि नंतर गणना सूत्रानुसार सापेक्ष मूल्याची गणना करा, जी सापेक्ष अभिव्यक्ती पातळी आहे.
फायदे: साधे विश्लेषण, तुलनेने सोपे प्रायोगिक ऑप्टिमायझेशन
गैरसोय: प्रत्येक जनुकासाठी, प्रयोगांच्या प्रत्येक फेरीत एक मानक वक्र असणे आवश्यक आहे
अर्ज: जनुक अभिव्यक्ती नियमनाच्या अभ्यासात सामान्यतः वापरल्या जाणार्‍या आणि ओळखल्या जाणार्‍या सापेक्ष परिमाणवाचक पद्धतींपैकी एक
सूत्र खालीलप्रमाणे आहे.

उदाहरणे खालीलप्रमाणे आहेत.

परिमाणवाचक परिणामावर आधारित सापेक्ष रकमेची गणना करा
2 – △△Ct पद्धत (CT मूल्य तुलना पद्धत)

फायदे: मानक वक्र करण्याची आवश्यकता नाही
तोटे: असे गृहीत धरले जाते की प्रवर्धन कार्यक्षमता 100% च्या जवळ आहे;मानक विचलन < 5% आहे, आणि मानक वक्र आणि प्रत्येक प्रवर्धन दरम्यानची कार्यक्षमता सुसंगत असल्याचे गृहीत धरले जाते;प्रायोगिक परिस्थितीचे ऑप्टिमायझेशन अधिक क्लिष्ट आहे.
अर्ज: जनुक अभिव्यक्ती नियमनाच्या अभ्यासात सामान्यतः वापरल्या जाणार्‍या आणि ओळखल्या जाणार्‍या सापेक्ष परिमाणवाचक पद्धतींपैकी एक

अर्थात, प्रवर्धक कार्यक्षमता पूर्णपणे 1 असणे अशक्य आहे. सुधारणा पद्धत: जर आपल्याला माहित असेल की लक्ष्य जनुक आणि संदर्भ जनुकामध्ये समान प्रवर्धन कार्यक्षमता आहे, परंतु प्रवर्धन कार्यक्षमता 1 च्या बरोबरीची नाही, तर 2－△△Ct याप्रमाणे दुरुस्त करता येईल: (1+C उदाहरणासाठी, amplification साठी 1+E) 0.95 आहे, नंतर गणना सूत्र 1.95－△△Ct मध्ये दुरुस्त करता येईल
आतापर्यंत, फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक पीसीआर बद्दलची सामग्री समाप्त झाली आहे.