रिअल टाइम पीसीआर प्राइमर डिझाइन तत्त्वे

फॉरवर्ड प्राइमर आणि रिव्हर्स प्राइमर

रिअल टाइम पीसीआरसाठी, प्राइमर डिझाइन खूप महत्वाचे आहे.प्राइमर्स पीसीआर प्रवर्धनाच्या विशिष्टतेशी आणि कार्यक्षमतेशी संबंधित आहेत आणि खालील तत्त्वांच्या संदर्भात डिझाइन केले जाऊ शकतात:

प्राइमर लांबी: 18-30bp.

जीसी सामग्री: 40-60%.

टीएम मूल्य: प्राइमर डिझाइन सॉफ्टवेअर, जसे की प्राइमर 5, प्राइमरचे टीएम मूल्य देऊ शकते.अपस्ट्रीम आणि डाउनस्ट्रीम प्राइमर्सची Tm मूल्ये शक्य तितक्या जवळ असावीत.Tm गणना सूत्र देखील वापरले जाऊ शकते: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).PCR करत असताना, 5 °C च्या प्राइमर Tm मूल्यापेक्षा कमी तापमान सामान्यत: अॅनिलिंग तापमान म्हणून निवडले जाते (अॅनलिंग तापमानातील संबंधित वाढ PCR प्रतिक्रियाची विशिष्टता वाढवू शकते).

प्राइमर्स आणि पीसीआर उत्पादने:

डिझाईन प्राइमर पीसीआर प्रवर्धन उत्पादनाची लांबी प्राधान्याने 100-150bp आहे.

टेम्प्लेटच्या दुय्यम संरचनात्मक क्षेत्रामध्ये डिझाइन प्राइमर्स शक्य तितके टाळले पाहिजेत.

अपस्ट्रीम आणि डाउनस्ट्रीम प्राइमर्सच्या 3′ टोकांच्या दरम्यान 2 किंवा अधिक पूरक बेस तयार करणे टाळा.

प्राइमर 3′ टर्मिनल बेस 3 अतिरिक्त सलग G किंवा C सह उपस्थित असू शकत नाही.

प्राइमरमध्ये स्वतःला पूरक संरचना असू शकत नाही, अन्यथा हेअरपिन रचना तयार होईल, ज्यामुळे पीसीआर प्रवर्धन प्रभावित होईल.

ATCG प्राइमर अनुक्रमात शक्य तितक्या समान रीतीने वितरित केले जावे आणि 3′ टर्मिनल बेसला T म्हणून टाळावे.

परिशिष्ट 1: सेल डायरेक्ट RT-qPCR किट घटक पूरक पॅक

1.सेल लिसिस सोल्यूशन