हे सर्वज्ञात आहे की केंद्रीय मतामध्ये, RNA हा DNA आणि प्रथिन अभिव्यक्ती दरम्यान ट्रान्सक्रिप्शनल मध्यस्थ आहे.डीएनए शोधण्याच्या तुलनेत, आरएनएचा शोध जीवांमध्ये जीन अभिव्यक्ती अधिक वस्तुनिष्ठपणे प्रतिबिंबित करू शकतो.RNA चा समावेश असलेल्या प्रयोगांमध्ये हे समाविष्ट आहे: qRT-PCR, RNA-Seq, आणि फ्यूजन जनुक शोधणे इ. RNA च्या वैशिष्ट्यांवर आधारित (RNA च्या साखरेच्या अंगठीमध्ये DNA च्या साखरेच्या अंगठीपेक्षा एक अधिक मुक्त हायड्रॉक्सिल गट असतो), वातावरणात मोठ्या संख्येने RNases सह, RNA अधिक अस्थिर आहे आणि DNA पेक्षा कमी करणे सोपे आहे.कचरा आत टाकणे, कचरा बाहेर टाकणे, जर RNA ची गुणवत्ता चांगली नसेल, तर प्रायोगिक परिणाम असमाधानकारक असणे आवश्यक आहे, विशेषत: चुकीचा डेटा किंवा खराब पुनरावृत्तीक्षमता म्हणून प्रकट.म्हणून, आरएनएच्या प्रक्रियेकडे अधिक लक्ष दिले पाहिजे आणि त्यानंतरच्या प्रायोगिक डेटाची अचूकता आणि अचूकता सुनिश्चित करण्यासाठी गुणवत्ता नियंत्रणाची लिंक देखील अधिक महत्त्वाची आहे.

RNA च्या गुणवत्ता नियंत्रणासाठी, सामान्यतः खालील पद्धती वापरल्या जातात:

• स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री
• agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस
• Agilent Bioanalyzer
• रिअल-टाइम फ्लोरोसेंट परिमाणवाचक पीसीआर
• क्यूबिट फ्लोरोसेंट डाई पद्धत

01 स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री

RNA मध्ये संयुग्मित दुहेरी बंध आहेत आणि 260nm च्या तरंगलांबीवर शोषण शिखर आहे.लॅम्बर्ट-बीअरच्या नियमानुसार, आम्ही शोषण शिखरावर 260nm पासून आरएनए एकाग्रतेची गणना करू शकतो.याव्यतिरिक्त, आम्ही 260nm, 280nm आणि 230nm शोषण शिखरांच्या गुणोत्तरानुसार RNA ची शुद्धता देखील मोजू शकतो.280nm आणि 230nm हे अनुक्रमे प्रथिने आणि लहान रेणूंचे शोषण शिखर आहेत.योग्य RNA शुद्धतेचे A260/A280 आणि A260/A230 चे गुणोत्तर 2 पेक्षा जास्त असावे. जर ते 2 पेक्षा कमी असेल, तर याचा अर्थ RNA नमुन्यात प्रथिने किंवा लहान रेणू दूषित आहेत आणि ते पुन्हा शुद्ध करणे आवश्यक आहे.दूषित स्त्रोत डाउनस्ट्रीम प्रयोगांवर परिणाम करतील, जसे की पीसीआर प्रतिक्रियांच्या प्रवर्धन कार्यक्षमतेस प्रतिबंध करणे, परिणामी चुकीचे परिमाणवाचक परिणाम.RNA च्या शुद्धतेचा नंतरच्या परिणामांवर मोठा प्रभाव पडतो, म्हणून स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री ही सामान्यत: न्यूक्लिक अॅसिड प्रयोगांच्या पहिल्या टप्प्यातील एक अपरिहार्य गुणवत्ता नियंत्रण दुवा आहे.

आकृती 1. ठराविक आरएनए/डीएनए शोषण स्पेक्ट्रम

02 Agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस

शुद्धतेव्यतिरिक्त, RNA ची अखंडता देखील RNA च्या गुणवत्तेचा न्याय करण्यासाठी एक महत्त्वाचा निर्देशक आहे.RNA च्या ऱ्हासामुळे नमुन्यात मोठ्या संख्येने लहान तुकड्या निर्माण होतील, त्यामुळे RNA तुकड्यांची संख्या कमी केली जाईल जे प्रभावीपणे शोधले जाऊ शकतात आणि संदर्भ क्रमाने कव्हर केले जाऊ शकतात.RNA अखंडता 1% agarose जेलवर एकूण RNA च्या इलेक्ट्रोफोरेसीसद्वारे तपासली जाऊ शकते.ही पद्धत स्वतः जेल कॉन्फिगर करू शकते किंवा अखंडता चाचणीसाठी पूर्वनिर्मित E-Gel™ प्रणाली वापरू शकते.एकूण RNA पैकी 80% पेक्षा जास्त RNA हे ribosomal RNA आहे, ज्यातील बहुतांश भाग 28S आणि 18S rRNA (सस्तन प्राण्यांच्या प्रणालींमध्ये) बनलेले आहेत.चांगल्या गुणवत्तेचे RNA दोन स्पष्ट ब्राइट बार दर्शवेल, जे अनुक्रमे 28S आणि 18S ब्राइट बार आहेत, 5 Kb आणि 2 Kb, आणि गुणोत्तर 2:1 च्या जवळ असेल.जर ते पसरलेल्या अवस्थेत असेल, तर याचा अर्थ RNA नमुना खराब झाला असावा आणि RNA ची गुणवत्ता तपासण्यासाठी नंतर वर्णन केलेली पद्धत वापरण्याची शिफारस केली जाते.

आकृती 2. अ‍ॅगरोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसवर डीग्रेड (लेन 2) आणि अखंड आरएनए (लेन 3) ची तुलना

03 Agilent Bioanalyzer

वर वर्णन केलेल्या अॅग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस पद्धती व्यतिरिक्त, जी आम्हाला RNA ची अखंडता सहज आणि त्वरीत ओळखण्यात मदत करू शकते, आम्ही RNA ची अखंडता निश्चित करण्यासाठी Agilent bioanalyzer देखील वापरू शकतो.हे RNA एकाग्रता आणि अखंडतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी मायक्रोफ्लुइडिक्स, केशिका इलेक्ट्रोफोरेसीस आणि फ्लूरोसेन्सचे संयोजन वापरते.RNA नमुन्याच्या प्रोफाइलचे विश्लेषण करण्यासाठी अंगभूत अल्गोरिदम वापरून, Agilent bioanalyzer संदर्भ RNA अखंडता मूल्य, RNA इंटिग्रिटी नंबर (यापुढे RIN म्हणून संदर्भित) [१] मोजू शकतो.RIN चे मूल्य जितके मोठे असेल तितके RNA ची अखंडता जास्त असेल (1 अत्यंत निकृष्ट आहे, 10 सर्वात पूर्ण आहे).RNA चा समावेश असलेले काही प्रयोग गुणवत्तेचे मूल्यमापन करण्यासाठी RIN हे पॅरामीटर म्हणून वापरण्याचे सुचवतात.उदाहरण म्हणून उच्च-थ्रूपुट सिक्वेन्सिंग प्रयोग (यापुढे NGS म्हणून संदर्भित) घेतल्यास, Oncomine™ Human Immune Repertoire ची मार्गदर्शक तत्त्वे, ज्याचा वापर थर्मो फिशरच्या Oncomine पॅनेल मालिकेतील B सेल आणि T सेल प्रतिजन रिसेप्टर्स शोधण्यासाठी केला जातो, असे सूचित करते की RIN मूल्ये असलेले नमुने 4, F पेक्षा जास्त वाचले जाऊ शकतात आणि 3, क्लोज मोजले जाऊ शकतात.वेगवेगळ्या पॅनेलसाठी वेगवेगळ्या शिफारस केलेल्या श्रेणी आहेत आणि बर्‍याचदा उच्च RIN अधिक प्रभावी डेटा आणू शकतो.

आकृती 3, Oncomine™ Human Immune Repertoire प्रयोगांमध्ये, 4 पेक्षा जास्त RIN असलेले नमुने अधिक प्रभावी वाचन आणि T सेल क्लोन शोधू शकतात.【2】

तथापि, RIN मूल्याला देखील काही मर्यादा आहेत.जरी RIN चा NGS प्रायोगिक डेटाच्या गुणवत्तेशी उच्च संबंध असला तरी, तो FFPE नमुन्यांसाठी योग्य नाही.FFPE नमुन्यांवर दीर्घकाळ रासायनिक उपचार केले गेले आहेत, आणि काढलेल्या RNA चे साधारणपणे तुलनेने कमी RIN मूल्य असते.तथापि, याचा अर्थ असा नाही की प्रयोगाचा प्रभावी डेटा असमाधानकारक असावा.FFPE नमुन्यांच्या गुणवत्तेचे अचूक मूल्यांकन करण्यासाठी, आम्हाला RIN व्यतिरिक्त इतर मोजमाप वापरण्याची आवश्यकता आहे.RIN व्यतिरिक्त, Agilent bioanalyzer RNA गुणवत्तेचे मूल्यमापन मापदंड म्हणून DV200 मूल्य देखील मोजू शकतो.DV200 हे एक पॅरामीटर आहे जे RNA नमुन्यातील 200 bp पेक्षा मोठ्या तुकड्यांचे प्रमाण मोजते.DV200 हे RIN पेक्षा FFPE नमुना गुणवत्तेचे चांगले सूचक आहे.FFPE द्वारे काढलेल्या RNA साठी, त्याचा प्रभावीपणे शोधल्या जाऊ शकणार्‍या जनुकांच्या संख्येशी आणि जनुकांच्या विविधतेशी खूप उच्च संबंध आहे [३].जरी DV200 FFPE च्या गुणवत्तेच्या शोधातील कमतरता भरून काढू शकतो, तरीही Agilent bioanalyzer RNA नमुन्यांमधील गुणवत्तेच्या समस्यांचे सर्वसमावेशक विश्लेषण करू शकत नाही, ज्यामध्ये नमुन्यांमध्ये अवरोधक आहेत की नाही.इनहिबिटर स्वतः डाउनस्ट्रीम प्रयोगांच्या प्रवर्धन कार्यक्षमतेवर परिणाम करू शकतात आणि उपयुक्त डेटाचे प्रमाण कमी करू शकतात.नमुन्यामध्ये इनहिबिटर आहे की नाही हे जाणून घेण्यासाठी, आम्ही पुढे वर्णन केलेल्या रिअल-टाइम फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक पीसीआर पद्धतीचा अवलंब करू शकतो.

04 रिअल-टाइम फ्लोरोसेंट परिमाणवाचक पीसीआर

रिअल-टाइम फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक PCR पद्धत केवळ नमुन्यातील अवरोधक शोधू शकत नाही, परंतु FFPE नमुन्यातील RNA ची गुणवत्ता देखील अचूकपणे प्रतिबिंबित करू शकते.Agilent जैविक विश्लेषकांच्या तुलनेत, रीअल-टाइम फ्लोरोसेन्स परिमाणवाचक उपकरणे त्यांच्या व्यापक वापरामुळे मोठ्या जैविक प्रयोगशाळांमध्ये अधिक लोकप्रिय आहेत.RNA नमुन्यांची गुणवत्ता तपासण्यासाठी, आम्हाला फक्त GUSB (Cat no. Hs00939627) सारख्या अंतर्गत संदर्भ जनुकांसाठी प्राइमर प्रोब खरेदी करणे किंवा तयार करणे आवश्यक आहे.परिपूर्ण परिमाणवाचक प्रयोग करण्यासाठी प्राइमर्स, प्रोब्स आणि मानकांचा (एकूण RNA ज्ञात एकाग्रतेचा) वापर करून, प्रभावी RNA फ्रॅगमेंट एकाग्रतेची गणना RNA गुणवत्तेचे मूल्यमापन मानक (थोडक्यात फंक्शनल RNA क्वांटिटेशन (FRQ)) म्हणून केली जाऊ शकते.NGS चाचणीमध्ये, आम्हाला आढळले की RNA नमुन्यांचा FRQ चा प्रभावी डेटा व्हॉल्यूमशी खूप उच्च संबंध आहे.0.2ng/uL FRQ पेक्षा मोठ्या सर्व नमुन्यांसाठी, किमान 70% वाचन प्रभावीपणे संदर्भ क्रम (आकृती 4) कव्हर करू शकतात.

आकृती 4, फ्लोरोसेन्स परिमाणवाचक पद्धतीद्वारे आढळलेल्या FRQ मूल्याचा NGS प्रयोगात प्राप्त झालेल्या प्रभावी डेटाशी खूप उच्च सहसंबंध (R2>0.9) आहे.लाल रेषा म्हणजे FRQ मूल्य 0.2 ng/uL (log10 = -0.7).【4】

FFPE नमुन्यांना लागू होण्याव्यतिरिक्त, रिअल-टाइम परिमाणवाचक PCR पद्धत देखील नमुन्यांमधील अवरोधकांचे प्रभावीपणे निरीक्षण करू शकते.आम्‍ही इंटरनल पॉझिटिव्ह कंट्रोल (IPC) आणि त्‍याच्या अ‍ॅसेसह रिअॅक्शन सिस्‍टममध्‍ये शोधण्‍यासाठी नमुना जोडू शकतो आणि नंतर Ct व्हॅल्यू मिळवण्‍यासाठी फ्लूरोसेंस क्वांटिफिकेशन करू शकतो.जर Ct मूल्य न-नमुन्याच्या प्रतिक्रियेमध्ये Ct मूल्यापेक्षा मागे असेल, तर ते सूचित करते की नमुन्यामध्ये अवरोधक उपस्थित आहे आणि प्रतिक्रियेतील प्रवर्धन कार्यक्षमतेस प्रतिबंधित करते.

05 क्यूबिट फ्लोरोसेंट डाई पद्धत

क्यूबिट फ्लोरोमीटर हे न्यूक्लिक अॅसिड एकाग्रता आणि शुद्धता शोधण्यासाठी सर्वात सामान्यपणे वापरले जाणारे छोटे उपकरण आहे, जे ऑपरेट करणे सोपे आहे आणि जवळजवळ प्रत्येक आण्विक जीवशास्त्र प्रयोगशाळेत अस्तित्वात आहे.हे न्यूक्लिक अॅसिड-बाइंडिंग फ्लोरोसेंट डाई (क्यूबिट डिटेक्शन अभिकर्मक) शोधून न्यूक्लिक अॅसिडच्या एकाग्रतेची अचूक गणना करते.क्यूबिटमध्ये उच्च संवेदनशीलता आणि विशिष्टता आहे, आणि ते pg/µL एकाग्रतेपर्यंत अचूकपणे RNA चे प्रमाण ठरवू शकतात.न्यूक्लिक अॅसिड एकाग्रता अचूकपणे मोजण्याच्या सुप्रसिद्ध क्षमतेच्या व्यतिरिक्त, थर्मो फिशरचे नवीनतम नवीन मॉडेल, Qubit 4.0, RNA ची अखंडता देखील ओळखू शकते.Qubit 4.0′s RNA डिटेक्शन सिस्टम (RNA IQ Assay) एकाच वेळी दोन विशिष्ट फ्लोरोसेंट रंग शोधून RNA ची अखंडता शोधते.हे दोन फ्लोरोसेंट रंग अनुक्रमे आरएनएच्या मोठ्या तुकड्यांना आणि लहान तुकड्यांना बांधू शकतात.हे दोन फ्लोरोसेंट रंग नमुन्यातील आरएनएच्या मोठ्या तुकड्यांचे प्रमाण दर्शवतात आणि त्यावरून आरएनए गुणवत्तेचे प्रतिनिधित्व करणारे IQ (एकात्मता आणि गुणवत्ता) मूल्य मोजले जाऊ शकते.IQ मूल्य हे FFPE आणि FFPE नसलेल्या दोन्ही नमुन्यांना लागू आहे आणि त्यानंतरच्या अनुक्रम गुणवत्तेवर त्याचा मोठा प्रभाव आहे.उदाहरण म्हणून NGS प्रयोग घेताना, Ion torrent™ प्लॅटफॉर्मवर केलेल्या RNA-Seq चाचणी प्रयोगांमध्ये, 4 पेक्षा जास्त IQ मूल्ये असलेल्या बहुतेक नमुन्यांमध्ये किमान 50% प्रभावी वाचन होते (आकृती 5).वर नमूद केलेल्या शोध पद्धतींच्या तुलनेत, Qubit IQ Assay केवळ ऑपरेट करणे अधिक सोयीस्कर नाही आणि कमी वेळ (पाच मिनिटांत) घेते, परंतु मोजलेले पॅरामीटर IQ मूल्य आणि डाउनस्ट्रीम प्रयोगांच्या डेटा गुणवत्तेमध्ये देखील चांगला संबंध आहे.

आकृती 5, क्यूबिट RNA IQ मूल्य आणि RNA-Seq चे मॅप केलेले रीड्स यांच्यात चांगला संबंध आहे.【5】

वरील प्रस्तावनेद्वारे, माझा विश्वास आहे की प्रत्येकाला वेगवेगळ्या RNA गुणवत्ता नियंत्रण पद्धतींची पुरेशी माहिती आहे.सराव मध्ये, आपण निवडू शकतानमुना प्रकार आणि विद्यमान साधनांनुसार संबंधित पद्धत.केवळ आरएनएच्या गुणवत्तेवर नियंत्रण ठेवून आपण नमुन्याच्या खराब गुणवत्तेमुळे पुढील प्रयोगांचे अपयश टाळू शकतो, त्यामुळे मौल्यवान वेळ, ऊर्जा आणि खर्च वाचतो.

संदर्भ उत्पादने:

प्राणी एकूण आरएनए अलगाव किट

सेल टोटल आरएनए अलगाव किट

संदर्भ

【1】श्रोडर, ए., म्युलर, ओ., स्टॉकर, एस. एट अल.RIN: RNA मोजमापांना अखंडता मूल्ये नियुक्त करण्यासाठी एक RNA अखंडता क्रमांक.BMC मॉलिक्युलर बायोल 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】ऑनकम ह्युमन इम्यून रिपर्टोअर वापरकर्ता मार्गदर्शक (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】लेह सी वेहमस, चार्ल्स ई वुड, ब्रायन एन चोर्ले, कॅरोल एल यौक, गेल एम नेल्सन, सुसान डी हेस्टर, आर्किव्हल फॉरमॅलिन-फिक्स्ड पॅराफिन-एम्बेडेड टिश्यू सॅम्पल, व्हॉल्यूमॉलॉजिकल इज 20, पृष्ठ 20, पान 01, ऑगस्‍ट 201 357-373,https://doi.org/10.1093/toxsci/