आम्ही अनुभवी निर्माता आहोत.मोठ्या सवलतीच्या चायना उच्च संवेदनशीलता वन-स्टेप प्रोब Rt- साठी त्याच्या बाजारातील महत्त्वपूर्ण प्रमाणपत्रांमध्ये बहुमत मिळवणेQpcrकिट V2, गुणवत्ता हे कारखान्याचे जीवन आहे, ग्राहकांच्या मागणीवर लक्ष केंद्रित करणे हे कंपनीचे अस्तित्व आणि विकासाचे स्त्रोत आहे, आम्ही प्रामाणिकपणा आणि सद्भावनेने काम करण्याच्या वृत्तीचे पालन करतो, तुमच्या येण्याची वाट पाहत आहोत!
आम्ही अनुभवी निर्माता आहोत.साठी त्याच्या बाजारातील महत्त्वपूर्ण प्रमाणपत्रांमध्ये बहुमत मिळवणेचायना ताक डीएनए पॉलिमरेझ, Qpcr, आमची कंपनी वचन देते: वाजवी किमती, कमी उत्पादन वेळ आणि विक्रीनंतरची समाधानकारक सेवा, तुम्हाला पाहिजे त्या वेळी आमच्या कारखान्याला भेट देण्यासाठी आम्ही तुमचे स्वागत करतो.आता आमचा एकत्र आनंददायी आणि दीर्घकालीन व्यवसाय व्हावा अशी इच्छा आहे!!!

वर्णने

हे किट एक अद्वितीय लिसिस बफर प्रणाली वापरते जी RT-qPCR प्रतिक्रियांसाठी संवर्धित सेल नमुन्यांमधून RNA द्रुतपणे सोडू शकते, ज्यामुळे वेळ घेणारी आणि कष्टदायक RNA शुद्धीकरण प्रक्रिया दूर होते.RNA टेम्पलेट फक्त 7 मिनिटांत मिळू शकते.किटद्वारे प्रदान केलेले 5×डायरेक्ट आरटी मिक्स आणि 2×डायरेक्ट qPCR मिक्स-SYBR अभिकर्मक रीअल-टाइम परिमाणवाचक पीसीआर परिणाम द्रुत आणि प्रभावीपणे प्राप्त करू शकतात.

5×डायरेक्ट RT मिक्स आणि 2×डायरेक्ट qPCR मिक्स-SYBR मध्ये मजबूत इनहिबिटर टॉलरन्स आहे आणि सॅम्पलचे लाइसेट थेट RT-qPCR साठी टेम्प्लेट म्हणून वापरले जाऊ शकते.या किटमध्ये अद्वितीय आरएनए हाय-अॅफिनिटी फोरजीन रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस आणि हॉट डी-टाक डीएनए पॉलिमरेज, डीएनटीपी, एमजीसीएल समाविष्ट आहे.₂, प्रतिक्रिया बफर, पीसीआर ऑप्टिमायझर आणि स्टॅबिलायझर.

तपशील

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

किटचे घटक

वैशिष्ट्ये आणि फायदे

■ सोपे आणि प्रभावी : सेल डायरेक्ट आरटी तंत्रज्ञानासह, आरएनए नमुने फक्त 7 मिनिटांत मिळू शकतात.

■ नमुन्याची मागणी कमी आहे, कमीत कमी 10 पेशींची चाचणी केली जाऊ शकते.

■ उच्च थ्रूपुट: हे 384, 96, 24, 12, 6-वेल प्लेट्समध्ये संवर्धित पेशींमध्ये आरएनए पटकन शोधू शकते.

■ डीएनए इरेजर त्वरीत प्रकाशीत जीनोम काढून टाकू शकतो, त्यानंतरच्या प्रायोगिक परिणामांवर होणारा परिणाम मोठ्या प्रमाणात कमी करू शकतो.

■ ऑप्टिमाइझ केलेली RT आणि qPCR प्रणाली द्वि-चरण RT-PCR रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन अधिक कार्यक्षम आणि PCR अधिक विशिष्ट आणि RT-qPCR प्रतिक्रिया अवरोधकांना अधिक प्रतिरोधक बनवते.

किट अर्ज

अर्जाची व्याप्ती: सुसंस्कृत पेशी.

- नमुना लिसिसद्वारे सोडलेला RNA: फक्त या किटच्या RT-qPCR टेम्पलेटला लागू.

- किटचा वापर खालील उद्देशांसाठी केला जाऊ शकतो: जनुक अभिव्यक्ती विश्लेषण, siRNA-मध्यस्थ जीन सायलेन्सिंग इफेक्टची पडताळणी, औषध तपासणी इ.

आकृती

स्टोरेज आणि शेल्फ लाइफ

या किटचा भाग I 4℃ वर संग्रहित केला पाहिजे;भाग II -20℃ वर संग्रहित केले पाहिजे.

फोरजीन प्रोटीज प्लस II 4℃ वर साठवले पाहिजे, -20℃ वर गोठवू नका.

अभिकर्मक 2×डायरेक्ट qPCR मिक्स-SYBR अंधारात -20℃ वर साठवले पाहिजे;वारंवार वापरल्यास, ते अल्पकालीन स्टोरेजसाठी 4℃ वर देखील साठवले जाऊ शकते (10 दिवसांच्या आत वापरा).आम्ही अनुभवी निर्माता आहोत.मोठ्या सवलतीच्या चायना उच्च संवेदनशीलता वन-स्टेप प्रोब Rt-Qpcr किट V2, गुणवत्ता म्हणजे फॅक्टरी जीवन, ग्राहकांच्या मागणीवर लक्ष केंद्रित करणे हे कंपनीचे अस्तित्व आणि विकासाचे स्त्रोत आहे, आम्ही प्रामाणिकपणा आणि सद्भावनेने काम करण्याच्या वृत्तीचे पालन करतो, तुमच्या येण्याची वाट पाहत आहोत!
मोठी सवलतचायना ताक डीएनए पॉलिमरेझ, Qpcr, आमची कंपनी वचन देते: वाजवी किमती, कमी उत्पादन वेळ आणि विक्रीनंतरची समाधानकारक सेवा, तुम्हाला पाहिजे त्या वेळी आमच्या कारखान्याला भेट देण्यासाठी आम्ही तुमचे स्वागत करतो.आता आमचा एकत्र आनंददायी आणि दीर्घकालीन व्यवसाय व्हावा अशी इच्छा आहे!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qपीसीआर Kit -ताक्मan

Cat.No.DRT-01021/01022

सेल डायरेक्ट RT-qPCR साठी ≤ 1000,000 सेल वापरून

उत्पादन परिचय

हे उत्पादन RT-qPCR प्रतिक्रियांसाठी संवर्धित सेल नमुन्यांमधून RNA द्रुतपणे सोडण्यासाठी, वेळ घेणारी आणि कष्टदायक RNA शुद्धिकरण प्रक्रिया काढून टाकण्यासाठी आणि आवश्यक RNA टेम्पलेट मिळविण्यासाठी केवळ 7 मिनिटे, 5× डायरेक्ट आरटी मिक्स, 2× डायरेक्ट qPCR मिक्ससह, 2× डायरेक्ट qPCR मिक्स-टाईम रिअल-टाईम-टाईम द्वारे प्रदान करण्यासाठी एक अद्वितीय लिसिस बफर प्रणाली वापरते. परिणाम

5× डायरेक्ट आरटी मिक्स आणि 2× डायरेक्ट qPCR मिक्स-टाकमनमध्ये मजबूत इनहिबिटर टॉलरन्स आहे आणि ते टेम्प्लेट म्हणून मोजल्या जाणार्‍या नमुन्याच्या लाइसेटचा वापर करून कार्यक्षम रिव्हर्सल आणि विशिष्ट प्रवर्धन करू शकतात.अभिकर्मकामध्ये फोरजीन रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस, हॉट डी-टाक डीएनए पॉलिमरेझ, डीएनटीपी, एमजीसीएल असते₂, रिअॅक्शन बफर, पीसीआर ऑप्टिमायझर आणि स्टॅबिलायझर, जे नमुने जलद आणि सहज शोधण्यासाठी लिसिस बफरसह वापरले जाऊ शकतात आणि उच्च संवेदनशीलता, विशिष्टता आणि स्थिरता ही वैशिष्ट्ये आहेत.

उत्पादन वैशिष्ट्ये

साधे, प्रभावी सेल डायरेक्ट आरटी तंत्रज्ञान जे RNA नमुने मिळविण्यासाठी 7 मिनिटे लागतात.

नमुना आवश्यकता लहान आहेत आणि प्रयोगासाठी किमान 10 सुसंस्कृत पेशी वापरल्या जाऊ शकतात.

384, 96, 24, 12, आणि 6-वेल प्लेट्स सारख्या सुसंस्कृत पेशींच्या जलद RNA संपादनासाठी उच्च थ्रूपुट.

डीएनए इरेजर त्वरीत प्रकाशीत जीनोम काढून टाकण्यास सक्षम आहे, त्यानंतरच्या प्रायोगिक परिणामांवर होणारा परिणाम मोठ्या प्रमाणात कमी करते.

ऑप्टिमाइझ केलेल्या RT आणि qPCR प्रणाली अधिक कार्यक्षम रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन, विशिष्टता आणि मजबूत RT-qPCR प्रतिक्रिया अवरोधक सहिष्णुतेसह द्वि-चरण RT-PCR सक्षम करतात.

किट अर्ज

अर्जाची व्याप्ती: सुसंस्कृत पेशी.

नमुना लिसिसचा अर्थ लावलेला RNA: फक्त दोन-चरण RT-qPCR टेम्पलेट म्हणून वापरला जातो.

खालील उद्देशांसाठी किटचा वापर केला जाऊ शकतो: जनुक नियामक अभिव्यक्ती विश्लेषण, एलील चाचणी, औषध तपासणी इ.

किट मर्यादा

प्रवर्धित तुकडे ≤ 300 bp.

किट्सचा वापर पेशींच्या ताज्या संवर्धनासाठी केला जातो.

उत्पादन गुणवत्ता नियंत्रण

FOREGENE च्या टोटल क्वालिटी मॅनेजमेंट सिस्टीमनुसार, सेल डायरेक्ट RT-qPCR सिरीज किटच्या प्रत्येक बॅचची किटच्या प्रत्येक बॅचच्या गुणवत्तेची विश्वासार्हता आणि स्थिरता सुनिश्चित करण्यासाठी अनेक वेळा कठोरपणे चाचणी केली जाते.

किट सामग्री

*:सेल लिसिस, 5×डायरेक्ट आरटी मिक्स, 2× डायरेक्ट क्यूपीसीआर मिक्स-टाकमन स्वतंत्रपणे खरेदी केले जाऊ शकतात, तपशील परिशिष्ट 1 (पृष्ठ 13) मध्ये प्रदान केले आहेत.

स्टोरेज परिस्थिती

1. शिपिंग अटी

कमी तापमानाच्या बर्फ पॅक बॉक्स वाहतुकीची संपूर्ण प्रक्रिया, किट <4 °C स्थितीत असल्याची खात्री करण्यासाठी.

2. स्टोरेज परिस्थिती

भाग I 4°C वर आणि भाग II -20°C वर साठवा.

फोरजीन प्रोटीज प्लस II 4°C वर साठवले पाहिजे, -20°C वर गोठलेले नाही.

अभिकर्मक 2× डायरेक्ट क्यूपीसीआर मिक्स-टाकमन -20 डिग्री सेल्सिअस, किंवा वारंवार वापरल्यास (10 दिवसांच्या आत) अल्पकालीन वापरासाठी 4°C वर साठवले जाते.

किट घटक माहिती

बफर सीएल: सेल लिसिस प्रतिक्रियांसाठी आवश्यक वातावरण प्रदान करते.

बफर एसटी: त्यानंतरच्या आरटीवर परिणाम टाळण्यासाठी लाइसेटमधील सक्रिय पदार्थ संपुष्टात आणतो.

डीएनए इरेजर: डीएनए रिमूव्हर, त्यानंतरच्या प्रयोगांवर जीनोम काढून टाकण्याचा परिणाम.

5× डायरेक्ट आरटी मिक्स: उच्च आरएनए ऍफिनिटी फोरजीन रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस, आरनेस इनहिबिटर, डीएनटीपी, स्टॅबिलायझर्स, एन्हान्सर्स, ऑप्टिमायझर्स आणि इष्टतम संरेखनासाठी रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्राइमर्स (रँडम प्राइमर, ऑलिगो(डीटी) समाविष्ट आहेत.₁₈प्राइमर).

फोरेजीन प्रोटीज प्लस II: लिसिस बफरच्या संदर्भात, न्यूक्लिक अॅसिड सोडण्यासाठी पेशी लायझ केल्या जातात.

2× डायरेक्ट क्यूपीसीआर मिक्स-टाकमन: या अभिकर्मकामध्ये हॉट डी-टाक डीएनए पॉलिमरेझ, डीएनटीपी, एमजीसीएल असते₂, प्रतिक्रिया बफर, PCR ऑप्टिमायझर आणि स्टॅबिलायझर.

20× ROX संदर्भ डाई: सामान्यतः ABI, Stratagene आणि इतर कंपन्यांच्या रिअल टाइम पीसीआर अॅम्प्लीफिकेशन साधनांवर वापरले जाते, ते पीसीआर डोसिंग त्रुटींमुळे पीसीआर ट्यूब आणि ट्यूबमधील फरक समायोजित करण्यासाठी वापरले जाते.वेगवेगळ्या साधनांसाठी आवश्यक 20× ROX संदर्भ डाई एकाग्रता भिन्न आहे आणि वापरकर्ता ते इन्स्ट्रुमेंटच्या शिफारस केलेल्या एकाग्रतेनुसार जोडू शकतो.

RNase-मुक्त ddH₂O: द्वि-चरण RT-qPCR प्रतिक्रियांसाठी RNase-मुक्त निर्जंतुकीकरण केलेले अल्ट्रा शुद्ध पाणी.

सावधगिरी:(किट वापरण्यापूर्वी खबरदारी काळजीपूर्वक वाचा)

नमुन्यांमधील क्रॉस-दूषितता टाळण्यासाठी प्रयोगाच्या ऑपरेशन पद्धतीकडे लक्ष द्या.

RNase दूषित होणे आणि RNA ऱ्हास टाळण्यासाठी प्रायोगिक वातावरण आणि भांडी यांच्या स्वच्छतेकडे लक्ष द्या.

ताजे किंवा चांगले जतन केलेले सेल नमुने घ्या आणि फ्रीझ-विरघळलेले सेल नमुने कधीही वापरू नका.

5× डायरेक्ट qPCR मिक्स, 2× डायरेक्ट qPCR मिक्स-टाकमनने वारंवार फ्रीझ-थॉ टाळले पाहिजे, अन्यथा त्याचा रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन आणि पीसीआर कार्यक्षमतेवर परिणाम होईल.

प्रीपाशिधाआधीऑपरेशन

हे किट वापरण्यापूर्वी सूचना काळजीपूर्वक वाचा.सेल डायरेक्ट RT-qPCR किट सोपे, सोयीस्कर आणि ऑपरेट करण्यासाठी जलद आहे, आणि सूचना संपूर्ण किट आणि ते योग्यरित्या कसे वापरावे याबद्दल संपूर्ण माहिती प्रदान करतात.कृपया वापरण्यापूर्वी आवश्यक प्रायोगिक साहित्य आणि उपकरणे तयार करा.

प्रायोगिक साहित्य आणि उपकरणे

◆ संस्कृती पेशी.

◆ 1.5 मिली किंवा 2 मिली, RNase-/DNase-फ्री सेंट्रीफ्यूज ट्यूब, RNase-/DNase-फ्री टीप, 0.2 मिली निर्जंतुक qPCR ट्यूब.

◆ qPCR मशीन, पिपेट, टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज (≥13,400×g) (प्रायोगिक गरजांवर अवलंबून), इ.

सुरक्षितता

◆ हे उत्पादन केवळ वैज्ञानिक संशोधनाच्या उद्देशाने आहे, कृपया ते औषध, क्लिनिकल, अन्न आणि सौंदर्यप्रसाधनासाठी वापरू नका.

◆ रसायने वापरताना, योग्य प्रयोगशाळेचे कपडे, हातमोजे, संरक्षक चष्मा इ.

ऑपरेशनमार्गदर्शक

परिशिष्ट 1 (पृष्‍ठ 13) मधील तपशीलांसाठी सेल लाइसिस सिस्‍टम, आरटी सिस्‍टम आणि क्यूपीसीआर रिअॅक्शन सोल्यूशन सप्लिमेंट पॅक स्वतंत्रपणे खरेदी केले जाऊ शकतात.

ऑपरेशन मार्गदर्शक

A: नमुना RNA प्रकाशन

1.पेशी प्रीट्रीटेड केल्या गेल्या: सेल कल्चर प्लेट थंड पीबीएसने धुवा, नंतर पेशी लिझ करा (10-10⁶), १०⁶ पेशींच्या प्रमाणापेक्षा, आरएनए काढण्यासाठी आणि शुद्धीकरणासाठी फोरजीन सेल एक आरएनए आयसोलेशन किट टोटल (DE-03111) किंवा अॅनिमल टोटल आरएनए अलगाव किट (DE-03011) ची शिफारस केली जाते.

१.१.अनुयायी पेशी (24- उदाहरण म्हणून वेल प्लेट)

1.1.1.प्रत्येक विहिरीतील पेशींची संख्या निश्चित करा, पेशींची संख्या 1 × 10 आहे हे निश्चित करा⁵, आणि कल्चर डिशमधून कल्चर माध्यम काढण्यासाठी पिपेट वापरा.

१.१.२.प्रत्येक विहिरीला 200 μl प्री-चिल्ड 1 × PBS घाला.वारंवार पायपीट करू नका आणि विहिरींमधून PBS काढा.प्लेट वाकवा आणि शक्य तितक्या PBS काढा.चरण 2 वर जा.

१.१.३.सेल कल्चर डिशमध्ये भिन्न सेल कल्चर डिश किंवा संदर्भ क्रमांक टेबल 1-1 सेल वॉशिंगसाठी प्री-कूल 1 × PBS जोडले गेले.

तक्ता1-1: पेशींच्या वेगवेगळ्या संख्येसाठी PBS डोस

नोंद:एक फर्म अनुयायी पेशी सुनिश्चित करण्यासाठी,वॉशिंग करताना मोठ्या प्रमाणात पेशींचे नुकसान टाळले जाते.

१.२.सच्छिद्र नसलेल्या प्लेट्समध्ये संवर्धित सस्पेंशन पेशी किंवा अनुयायी पेशी

१.२.१.नॉन-मल्टी वेल प्लेट्समध्ये (निलंबन पेशी पुढील चरण 1.2.2 पासून सुरू होतात) मध्ये संवर्धित अनुयायी पेशी, सामान्य सेल संग्रह पद्धतीनुसार पेशी गोळा करा आणि वेगळे करा आणि त्यांना कल्चर प्लेट किंवा सेंट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये ठेवा;ट्रिप्सिनायझेशन वापरले असल्यास, पेशी गोळा करण्यासाठी आणि अवशिष्ट ट्रिप्सिन काढून टाकण्यासाठी सेंट्रीफ्यूगेशन आवश्यक आहे, पेशी विखुरण्यासाठी वैयक्तिक पेशींमध्ये PBS रीस्पेंड केलेल्या पेशी जोडल्या जातात.

१.२.२.पेशींची संख्या मोजल्यानंतर, सेल 1×10 अलिकोट केले⁵ एक ते सेंट्रीफ्यूज ट्यूब, 10 मिनिटांसाठी 1000 × g वर सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे पेशी गोळा करा.

१.२.३.सेंट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये 200 μl PBS जोडा, वारंवार पायपेट करू नका आणि PBS थेट ऍस्पिरेट करा.चरण 2 वर जा. (जर अवक्षेपण करणे कठीण असेल आणि पेशी पुन्हा निलंबित केल्या गेल्या असतील तर, 1000×g सेंट्रीफ्यूज केले जाऊ शकते 10 मिनिटांनी सुपरनॅटंट टाकून दिल्यावर, सेल पेलेट चरण 2 वर जा)

2.सेल लिसिस: बफर सीएल काढून टाका, त्याचे तापमान खोलीच्या तापमानाला संतुलित करा, डीएनए इरेजर आणि फोरजीन प्रोटीज प्लस II, खालील सारणी 1-2 तयार केलेल्या लिसिस सिस्टमनुसार: (लायसिस सोल्यूशन वापरासाठी तयार आहे).

तक्ता 1-2: क्लीवेज प्रणालीची तयारी (टीप: बर्फावरील तयारीमध्ये)

3.( 24 -विहीर प्लेट ) प्रत्येक विहिरीत 200 μl सेल लिसिस मास्टर पिपेट मिसळा, वारंवार 5-10 वेळा फुंकवा, खोलीच्या तपमानावर (20-25 ℃) 5 मिनिटांसाठी उष्मायन करा.

नोंद:बुडबुडे तयार होण्यापासून टाळण्यासाठी, कृपया पिपेटिंग विंदुक स्केल 200μl किंवा त्यापेक्षा कमी समायोजित केले जाईल.लिसिस नंतर पेशी ढगाळ दिसू शकतात, जे सामान्य आहे.

4. (उदाहरणार्थ 24 -वेल प्लेट) द्रव 20 μl बफर एसटीमध्ये जोडले जाते (वेगवेगळ्या लिसिस सिस्टम बफर एसटी टेबल 1-3 मध्ये दर्शविलेल्या रकमेमध्ये जोडल्या जातात), 5-10 वेळा पुनरावृत्ती पाइपटिंग, खोलीच्या तपमानावर (20-25 ℃) 2 मिनिटांसाठी उष्मायन केले जाते.

नोंद:विंदुक टीप पृष्ठभागाच्या खाली विल्हेवाट लावली जाते, हे सुनिश्चित करते की लाइसेट जोडले गेले आहे,बुडबुडे तयार होऊ नयेत म्हणून, कृपया जेव्हा पिपेट स्केल 200μl किंवा त्यापेक्षा कमी समायोजित केले गेले तेव्हा.

तक्ता 1-3:बफर एसटी जोडा

5. लायसेटचा वापर त्यानंतरच्या RT-qPCR प्रयोगांसाठी केला जातो.त्यानंतरचे प्रयोग वेळेत करता येत नसल्यास, कृपया ते बर्फावर 2 तासांपेक्षा जास्त काळ ठेवा आणि -20 ℃ किंवा -80 ℃ (तीन महिन्यांपेक्षा जास्त नाही) वर साठवा.

बी: आरटी सिस्टमची तयारी

1. 5 × डायरेक्ट आरटी मिक्स काढा आणि बर्फाच्या आंघोळीवर ठेवा, ते नैसर्गिकरित्या वितळू द्या आणि नंतर वापरण्यासाठी हलक्या हाताने मिक्स करा;RNase-Free ddH2O काढा आणि ते वितळवा आणि नंतर वापरण्यासाठी बर्फाच्या बाथवर ठेवा.खालील तक्त्या 2-1 नुसार बर्फावर प्रतिक्रिया प्रणाली तयार करा.

तक्ता 2-1: RT प्रतिक्रिया प्रणालीची तयारी

2.सिस्टम फॉर्म्युलेशन पूर्ण झाल्यानंतर, हळुवारपणे मिश्रित आणि थोडक्यात खालील तक्त्यामध्ये सेंट्रीफ्यूज 2 -2 प्रतिक्रिया स्थिती RT प्रतिक्रिया.

सारणी 2-2: RT प्रतिक्रिया स्थिती सेटिंग

3. प्रतिक्रिया पूर्ण झाल्यानंतर, प्रतिक्रिया उत्पादन थेट बर्फावर qPCR साठी ठेवले गेले, कृपया दीर्घकालीन संरक्षण -20℃ किंवा -80 ℃ ठेवा.

टीप: नॉन-प्युरिफाईड टेम्प्लेटच्या वापरामुळे, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन उत्पादनामध्ये पांढरे प्रक्षेपण दिसू शकतात.ही एक सामान्य घटना आहे.त्यानंतरच्या प्रयोगांसाठी ताबडतोब सुपरनेटंट सेंट्रीफ्यूज करा.

परिणामी RT रिअॅक्शन सोल्यूशन पुढील स्टेप रिअल टाइम पीसीआर रिअॅक्शन सिस्टममध्ये जोडले जाते, प्रतिक्रिया प्रणालीच्या 10-30% पर्यंत रक्कम जोडण्याची शिफारस केली जाते.

C: qPCR प्रतिक्रिया प्रणालीची तयारी

1. प्रतिक्रिया प्रणाली तयार करण्यासाठी खालील तक्त्या 3-1 नुसार चरण cDNA टेम्प्लेटमध्ये तयार केलेल्या B ची योग्य मात्रा.

टीप: cDNA टेम्पलेटचे प्रमाण qPCR प्रणालीच्या 10-30% आहे.उदाहरणार्थ, 20μl qPCR प्रणालीमध्ये, 2-6 μl लिसिस बफर जोडा, परंतु 6 μl पेक्षा जास्त नाही.

2. qPCR प्रतिक्रियेसाठी ऑप्टिमायझेशन चांगली qPCR परिस्थिती (एनीलिंग तापमान，इ.) (टेबल 3-2 वर दिलेल्या प्रतिक्रिया परिस्थिती).

टीप: चांगले परिणाम मिळविण्यासाठी qPCR प्रतिक्रियांसाठी अनुकूल परिस्थिती वापरण्याचा प्रयत्न करा.

तक्ता 3-1: पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणालीची तयारी

1*: जेव्हा प्राइमरची प्रतिक्रिया खराब असते तेव्हा प्राइमर एकाग्रता 50-900 nM च्या श्रेणीमध्ये समायोजित केली जाऊ शकते.

टीप: प्रायोगिक गरजा आणि फ्लूरोसेन्स सायकलर मॉडेलनुसार qPCR प्रणाली समायोजित केली जाऊ शकते.50 मध्ये qPCR साठीμl प्रणाली, 20 नुसार अभिकर्मक डोस प्रमाणानुसार समायोजित कराμl प्रणाली.

2*: फ्लोरोसेन्स परिमाणात्मक थर्मल सायकलरनुसार ROX संदर्भ डाईचे योग्य अंतिम एकाग्रता निवडा.सामान्य फ्लोरोसेन्स परिमाणात्मक सायकलर्ससाठी सर्वात योग्य ROX संदर्भ डाई सांद्रता खालील तक्त्यामध्ये दर्शविली आहे:

तक्ता 3-2: qPCR प्रतिक्रिया परिस्थिती प्रदान केल्या आहेत

टीप: सर्वोत्कृष्ट qPCR प्रभाव प्राप्त करण्यासाठी, ग्रेडियंट PCR वेगवेगळ्या टेम्पलेट्स आणि भिन्न प्राइमर्ससाठी प्रतिक्रिया परिस्थिती अनुकूल करण्यासाठी वापरला जाऊ शकतो.PCR प्रतिक्रिया परिस्थिती फ्लोरोसेन्स विश्लेषक, टेम्पलेट, प्राइमर इ. वर अवलंबून असते. विशिष्ट ऑपरेशनमध्ये, इष्टतम प्रतिक्रिया परिस्थिती फ्लूरोसेन्स परिमाणात्मक थर्मल सायकलरच्या विशिष्ट परिस्थितीनुसार डिझाइन करणे आवश्यक आहे, टेम्पलेटचा प्रकार, स्वारस्याच्या तुकड्याचा आकार, प्रवर्धित भागाचा बेस अनुक्रम आणि प्रिझम रिअॅक्शनची लांबी, जी तापमान सामग्रीची लांबी आणि तापमान इ.

रिअल टाइम पीसीआर प्राइमर डिझाइन तत्त्वे

फॉरवर्ड प्राइमर आणि रिव्हर्स प्राइमर

रिअल टाइम पीसीआरसाठी, प्राइमर डिझाइन खूप महत्वाचे आहे.प्राइमर्स पीसीआर प्रवर्धनाच्या विशिष्टतेशी आणि कार्यक्षमतेशी संबंधित आहेत आणि खालील तत्त्वांच्या संदर्भात डिझाइन केले जाऊ शकतात:

◆ प्राइमर लांबी: 18-30bp.

◆ GC सामग्री: 40-60%.

◆ Tm मूल्य: प्राइमर डिझाइन सॉफ्टवेअर, जसे की प्राइमर 5, प्राइमरचे Tm मूल्य देऊ शकते.अपस्ट्रीम आणि डाउनस्ट्रीम प्राइमर्सची Tm मूल्ये शक्य तितक्या जवळ असावीत.Tm गणना सूत्र देखील वापरले जाऊ शकते: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).PCR करत असताना, 5 °C च्या प्राइमर Tm मूल्यापेक्षा कमी तापमान सामान्यत: अॅनिलिंग तापमान म्हणून निवडले जाते (अॅनलिंग तापमानातील संबंधित वाढ PCR प्रतिक्रियाची विशिष्टता वाढवू शकते).

◆ प्राइमर्स आणि पीसीआर उत्पादने:

◆ डिझाईन प्राइमर PCR प्रवर्धक उत्पादनाची लांबी प्राधान्याने 100-150bp आहे.

◆ टेम्प्लेटच्या दुय्यम स्ट्रक्चरल भागात डिझाईन प्राइमर्स शक्य तितके टाळले पाहिजेत.

◆ अपस्ट्रीम आणि डाउनस्ट्रीम प्राइमर्सच्या 3′ टोकांच्या दरम्यान 2 किंवा अधिक पूरक आधार तयार करणे टाळा.

◆ प्राइमर 3′ टर्मिनल बेस 3 अतिरिक्त सलग G किंवा C सह उपस्थित असू शकत नाही.

◆ प्राइमरमध्ये स्वतः पूरक संरचना असू शकत नाही, अन्यथा हेअरपिन रचना तयार होईल, ज्यामुळे पीसीआर प्रवर्धन प्रभावित होईल.

◆ ATCG प्राइमर अनुक्रमात शक्य तितक्या समान रीतीने वितरित केले जावे आणि 3′ टर्मिनल बेसला T म्हणून टाळावे.

परिशिष्ट1:Cएल डायरेक्टRT-qPCR किट घटकटी पूरक पॅक

1.सेल लिसिस सोल्यूशन