विंदुक टिपा आणि ईपी ट्यूब्सचे निर्जंतुकीकरण इ.

1. डीआयोनाइज्ड पाण्याने 0.1% (एक हजारवा) DEPC (अत्यंत विषारी पदार्थ) तयार करा, त्याचा फ्युम हुडमध्ये काळजीपूर्वक वापर करा आणि ते प्रकाशापासून 4°C दूर ठेवा;

DEPC पाणी हे शुद्ध पाणी आहे जे DEPC द्वारे उपचार केले जाते आणि उच्च तापमान आणि उच्च दाबाने निर्जंतुक केले जाते.RNase, DNase आणि प्रोटीनेज मुक्त होण्यासाठी चाचणी केली.

2. पिपेट टीप आणि EP ट्यूब 0.1% DEPC मध्ये ठेवा आणि विंदुकाची टीप आणि EP ट्यूब 0.1% DEP ने भरलेली असल्याची खात्री करा.

3. प्रकाशापासून संरक्षण करा, रात्रभर उभे राहू द्या (12-24 तास)

4. टीप आणि EP ट्यूब असलेल्या बॉक्सला DEPC मध्ये भिजवण्याची गरज नाही.टिप किंवा EP ट्यूबमधील DEPC पाणी अंदाजे काढून टाकल्यानंतर, ते पॅक करा आणि ते गुंडाळा.

5. 121 अंश सेल्सिअस, 30 मि

6. 180 अंश सेल्सिअस, कित्येक तास कोरडे (किमान 3 तास)

टीप: अ.DEPC हाताळताना लेटेक्स हातमोजे आणि मास्क घाला!b, किंवा DEPC निर्जंतुकीकरणाशिवाय, 130 ℃, 90min ऑटोक्लेव्ह (अनेक प्रयोगशाळांमध्ये दोनदा उच्च तापमान नसबंदी)

आरएनए निष्कर्षण विचार

टिश्यू आरएनए अलगाव अपयशाच्या दोन प्रमुख घटना

आरएनए ऱ्हास आणि ऊतींमधील अशुद्धतेचे अवशेष,अधोगतीबाबत, प्रथम सुसंस्कृत पेशींमधून काढलेले आरएनए सहजासहजी का कमी होत नाही ते पाहू.विद्यमान RNA निष्कर्षण अभिकर्मकांमध्ये सर्व घटक असतात जे RNase ला वेगाने प्रतिबंधित करतात.संवर्धित पेशींमध्ये लायसेट जोडा आणि फक्त ते मिसळा, सर्व पेशी लाइसेटमध्ये पूर्णपणे मिसळल्या जाऊ शकतात आणि पेशी पूर्णपणे लाइसेट केल्या जातात.पेशी लाइसेड झाल्यानंतर, लाइसेटमधील सक्रिय घटक इंट्रासेल्युलर RNase ला त्वरित प्रतिबंधित करतात, त्यामुळे RNA शाबूत राहते.म्हणजेच संवर्धित पेशी लाइसेटशी सहज आणि पूर्णपणे संपर्क साधत असल्यामुळे त्यांचा आरएनए सहजासहजी खराब होत नाही;दुसरीकडे, ऊतींमधील आरएनए सहजपणे खराब होते कारण ऊतींमधील पेशींना लाइसेटशी पटकन संपर्क साधणे सोपे नसते.पुरेशा संपर्कामुळे.तर,आरएनए क्रियाकलाप रोखताना ऊतींचे एका पेशीमध्ये रूपांतर करण्याचा मार्ग आहे असे गृहीत धरल्यास, ऱ्हासाची समस्या पूर्णपणे सोडविली जाऊ शकते.

लिक्विड नायट्रोजन मिलिंग ही अशी सर्वात प्रभावी पद्धत आहे.तथापि, द्रव नायट्रोजन मिलिंग पद्धत खूप त्रासदायक आहे, विशेषत: जेव्हा नमुन्यांची संख्या मोठी असते.यामुळे पुढील सर्वोत्कृष्ट गोष्टीला जन्म दिला: होमोजेनायझर.दहोमोजनायझरपेशी लाइसेटशी संपर्क साधण्यापूर्वी RNase क्रियाकलाप कसा रोखला जातो या प्रश्नावर पद्धत विचारात घेत नाही, तर उलट प्रार्थना करते की पेशींच्या व्यत्ययाचा दर इंट्रासेल्युलर RNase RN ला ज्या दराने कमी करतो त्यापेक्षा वेगवान आहे.

इलेक्ट्रिक होमोजेनायझरचा प्रभाव चांगला आहे,आणि काचेच्या होमोजेनायझरचा प्रभाव खराब आहे, परंतु सर्वसाधारणपणे, होमोजेनायझर पद्धत ऱ्हासाची घटना रोखू शकत नाही.म्हणून, जर उतारा निकृष्ट असेल, तर द्रव नायट्रोजनसह पीसण्यासाठी मूळ इलेक्ट्रिक होमोजेनायझरचा वापर करावा;मूळ काचेच्या होमोजेनायझरला इलेक्ट्रिक होमोजेनायझरमध्ये बदलले पाहिजे किंवा थेट द्रव नायट्रोजनसह मिल्ड केले पाहिजे.समस्या जवळजवळ 100% व्यवहार्य आहे.निराकरण करा.

त्यानंतरच्या प्रयोगांना प्रभावित करणार्‍या अशुद्धतेच्या अवशेषांच्या समस्येमध्ये ऱ्हासापेक्षा अधिक वैविध्यपूर्ण कारणे आहेत आणि त्या अनुषंगाने उपाय भिन्न आहेत.अनुमान मध्ये,टिश्यूमध्ये ऱ्हास किंवा अवशिष्ट अशुद्धता असल्यास, विशिष्ट प्रायोगिक सामग्रीसाठी निष्कर्षण पद्धत/अभिकर्मक ऑप्टिमाइझ करणे आवश्यक आहे.ऑप्टिमायझेशनसाठी तुम्हाला तुमचे मौल्यवान नमुने वापरण्याची गरज नाही: तुम्ही बाजारातून मासे/चिकन सारखे काही लहान प्राणी खरेदी करू शकता, RNA काढण्यासाठी सामग्रीचा संबंधित भाग घेऊ शकता आणि प्रथिने काढण्यासाठी दुसरा भाग घेऊ शकता - तोंड, पोट आणि आतड्यांचा अर्क घेऊन बारीक करा.

काढलेल्या आरएनएचा लक्ष्य आरएनए वेगवेगळ्या फॉलो-अप प्रयोगांसाठी वापरला जातो आणि त्याच्या गुणवत्तेची आवश्यकता वेगळी असते.

सीडीएनए लायब्ररीच्या बांधकामासाठी एंजाइम रिअॅक्शन इनहिबिटरच्या अवशेषांशिवाय आरएनए अखंडता आवश्यक आहे;उत्तरेला उच्च आरएनए अखंडता आणि एंजाइम प्रतिक्रिया अवरोधक अवशेषांसाठी कमी आवश्यकता आवश्यक आहे;RT-PCR ला खूप जास्त RNA अखंडता आवश्यक नसते,परंतु एंजाइमच्या प्रतिक्रियांना प्रतिबंधित करते.अवशेष आवश्यकता कठोर आहेत.इनपुट आउटपुट निश्चित करते;प्रत्येक वेळी सर्वोच्च शुद्धता RNA मिळवण्याचे ध्येय असेल, तेव्हा लोक आणि पैसा खर्च होईल.

नमुन्यांचे संकलन/स्टोरेज

निकृष्टतेवर परिणाम करणारे घटक नमुन्याने जिवंत शरीर/किंवा मूळ वाढीच्या वातावरणातून बाहेर पडल्यानंतर, नमुन्यातील अंतर्जात एन्झाईम्स आरएनएचे विघटन करण्यास सुरवात करतात,आणि ऱ्हास दर अंतर्जात एन्झाईम्स आणि तापमानाच्या सामग्रीशी संबंधित आहे.पारंपारिकपणे, अंतर्जात एंझाइम क्रियाकलाप पूर्णपणे रोखण्याचे दोनच मार्ग आहेत: ताबडतोब लाइसेट घाला आणि पूर्णपणे आणि वेगाने एकरूप करा;लहान तुकडे करा आणि लगेच द्रव नायट्रोजनमध्ये गोठवा.दोन्ही पद्धतींना जलद ऑपरेशन आवश्यक आहे.नंतरचे सर्व नमुन्यांसाठी योग्य आहे, तर पूर्वीचे केवळ पेशी आणि अंतर्जात एन्झाईम्सची कमी सामग्री असलेल्या ऊतकांसाठी योग्य आहे आणि एकजिनसी करणे सोपे आहे.विशेषत:, वनस्पतीच्या ऊती, यकृत, थायमस, स्वादुपिंड, प्लीहा, मेंदू, चरबी, स्नायू ऊतक इ. पुढे जाण्यापूर्वी द्रव नायट्रोजनसह सर्वोत्तम गोठलेले असतात.

नमुन्यांचे विखंडन आणि एकसंधीकरण

ऱ्हास आणि उत्पन्नावर परिणाम करणारे घटक नमुना विखंडन आहेसंपूर्ण एकरूपतेसाठी, जे आरएनएच्या पूर्ण आणि पूर्ण प्रकाशनासाठी आहे.पेशी तुटल्याशिवाय थेट एकरूप होऊ शकतात.उती तुटल्यानंतरच एकरूप होऊ शकतात.यीस्ट आणि बॅक्टेरिया एकसंध बनवण्याआधी त्यांना संबंधित एंजाइमसह तोडणे आवश्यक आहे.कमी अंतर्जात एंझाइम सामग्री आणि सोपे एकसंधीकरण असलेल्या ऊतींना होमोजेनायझरद्वारे लाइसेटमध्ये एका वेळी चिरडले जाऊ शकते आणि एकजिनसीकरण केले जाऊ शकते;वनस्पती ऊती, यकृत, थायमस, स्वादुपिंड, प्लीहा, मेंदू, चरबी, स्नायू ऊतक आणि इतर नमुने, ते एकतर अंतर्जात एन्झाईम्समध्ये जास्त असतात किंवा सहज एकसमान होत नाहीत,त्यामुळे ऊतींचे व्यत्यय आणि एकजिनसीपणा स्वतंत्रपणे करणे आवश्यक आहे.फ्रॅगमेंटेशनची सर्वात विश्वासार्ह आणि सर्वात उत्पादक पद्धत म्हणजे द्रव नायट्रोजनसह मिलिंग आणि एकसंधीकरणाची सर्वात विश्वासार्ह पद्धत म्हणजे इलेक्ट्रिक होमोजेनायझरचा वापर.लिक्विड नायट्रोजनसह मिलिंगबद्दल एक विशेष टीप: संपूर्ण मिलिंग प्रक्रियेदरम्यान नमुना वितळला जाऊ नये, कारण गोठल्यावर अंतर्जात एन्झाईम कार्य करण्याची अधिक शक्यता असते.

लिसेटची निवड

ऑपरेशनची सोय आणि अवशिष्ट अंतर्जात अशुद्धतेचे घटक प्रभावित करणारे सामान्यतः वापरले जाणारे लिसिस सोल्यूशन्स RNase च्या क्रियाकलापांना जवळजवळ रोखू शकतात.म्हणून, लिसिस सोल्यूशन निवडण्याचा मुख्य मुद्दा म्हणजे शुध्दीकरण पद्धतीसह एकत्रितपणे विचार करणे.एक अपवाद आहे:अंतर्जात एन्झाइमची उच्च सामग्री असलेल्या नमुन्यांना अंतर्जात एन्झाइम निष्क्रिय करण्याची क्षमता वाढवण्यासाठी फिनॉल असलेले लाइसेट वापरण्याची शिफारस केली जाते.

शुद्धीकरण पद्धतीची निवड

अवशिष्ट अंतर्जात अशुद्धता, निष्कर्षण गतीवर परिणाम करणारे घटक पेशींसारख्या स्वच्छ नमुन्यांसाठी, जवळजवळ कोणत्याही शुद्धीकरण पद्धतीसह समाधानकारक परिणाम मिळू शकतात.परंतु इतर अनेक नमुन्यांसाठी, विशेषत: ज्यांच्यामध्ये वनस्पती, यकृत, बॅक्टेरिया इत्यादीसारख्या उच्च पातळीतील अशुद्धता आहेत, योग्य शुद्धीकरण पद्धत निवडणे महत्त्वाचे आहे.स्तंभ केंद्रापसारक शुद्धीकरण पद्धतीमध्ये जलद निष्कर्षण गती असते आणि आरएनएच्या नंतरच्या एन्झाइमॅटिक प्रतिक्रियेवर परिणाम करणारी अशुद्धता प्रभावीपणे काढून टाकू शकते, परंतु ते महाग आहे(फोरजीन स्वस्त-प्रभावी किट देऊ शकते, अधिक तपशील क्लिक करायेथे);किफायतशीर आणि क्लासिक शुद्धीकरण पद्धती वापरून, जसे की LiCl पर्जन्य, देखील समाधानकारक परिणाम प्राप्त करू शकतात, परंतु ऑपरेशनची वेळ मोठी आहे..

आरएनए एक्सट्रॅक्शनसाठी "तीन शिस्त आणि आठ लक्ष".

शिस्त 1:एक्सोजेनस एन्झाईम्सच्या दूषिततेचा अंत करा.

टीप 1:काटेकोरपणे मास्क आणि हातमोजे घाला.

टीप 2:प्रयोगात सहभागी असलेल्या सेंट्रीफ्यूज ट्यूब, टिप हेड, विंदुक रॉड, इलेक्ट्रोफोरेसीस टाक्या आणि प्रायोगिक बेंच यांची पूर्णपणे विल्हेवाट लावली पाहिजे.

टीप 3:प्रयोगातील अभिकर्मक/सोल्यूशन्स, विशेषतः पाणी, RNase-मुक्त असणे आवश्यक आहे.

शिस्त 2:अंतर्जात एन्झाईम्सची क्रिया अवरोधित करा

टीप ४:एक योग्य एकसंध पद्धत निवडा.

टीप 5:योग्य लायसेट निवडा.

टीप 6:नमुन्याची सुरुवातीची रक्कम नियंत्रित करा.

शिस्त 3:तुमचा उतारा उद्देश स्पष्ट करा

टीप 7:कोणतीही लाइसेट प्रणाली नमुन्याच्या जास्तीत जास्त प्रारंभिक रकमेपर्यंत पोहोचल्यावर, निष्कर्षण यशाचा दर झपाट्याने कमी होतो.

टीप 8:यशस्वी RNA काढण्याचा एकमेव आर्थिक निकष म्हणजे नंतरच्या प्रयोगांमध्ये यश, उत्पन्न नाही.

RNase दूषित होण्याचे शीर्ष 10 स्त्रोत

1. बोटांनी एक्सोजेनस एन्झाईम्सचा पहिला स्त्रोत आहे, म्हणून हातमोजे घालणे आणि वारंवार बदलणे आवश्यक आहे.याव्यतिरिक्त, मास्क देखील परिधान करणे आवश्यक आहे, कारण श्वास घेणे देखील एन्झाईम्सचा एक महत्त्वाचा स्त्रोत आहे.ग्लोव्ह मास्क घालण्याचा अतिरिक्त फायदा म्हणजे प्रयोगकर्त्याचे संरक्षण करणे.

2. पिपेट टिप्स, सेंट्रीफ्यूज ट्यूब्स, पिपेट्स - RNase केवळ निर्जंतुकीकरणाद्वारे निष्क्रिय केले जाऊ शकत नाही, म्हणून विंदुक टिपा आणि सेंट्रीफ्यूज ट्यूब्सवर DEPC द्वारे उपचार केले जावे, जरी ते DEPC उपचारित म्हणून चिन्हांकित केले असले तरीही.विशेष उद्देशाने पिपेट वापरणे चांगले आहे, वापरण्यापूर्वी 75% अल्कोहोल कॉटन बॉलने पुसून टाका, विशेषत: रॉड;याव्यतिरिक्त, हेड रिमूव्हर न वापरण्याची खात्री करा.

3. पाणी/बफर RNase दूषित होण्यापासून मुक्त असणे आवश्यक आहे.

4. किमान चाचणी टेबल 75% अल्कोहोल कॉटन बॉल्सने स्वच्छ पुसले पाहिजे.

5.Endogenous RNase सर्व ऊतींमध्ये अंतर्जात एन्झाईम्स असतात, त्यामुळे द्रव नायट्रोजनसह ऊतींचे जलद गोठवणे हा ऱ्हास कमी करण्याचा सर्वोत्तम मार्ग आहे.लिक्विड नायट्रोजन स्टोरेज/ग्राइंडिंग पद्धत खरोखरच गैरसोयीची आहे, परंतु अंतर्जात एन्झाईमची उच्च पातळी असलेल्या ऊतींसाठी हा एकमेव मार्ग आहे.

6. आरएनए नमुने आरएनए निष्कर्षण उत्पादनांमध्ये RNase दूषिततेचे ट्रेस असू शकतात.

7. प्लाझमिड एक्स्ट्रक्शन प्लाझमिड एक्स्ट्रॅक्शन RNA कमी करण्यासाठी Rnase चा वापर करते, आणि अवशिष्ट Rnase प्रोटीनेज K सह पचवले जावे आणि PCI द्वारे काढले जावे.

8. RNA स्टोरेज जरी ते कमी तापमानात साठवले गेले तरी, RNase च्या ट्रेस प्रमाणामुळे RNA ऱ्हास होईल.RNA च्या दीर्घकालीन संरक्षणासाठी सर्वोत्तम उपाय म्हणजे मीठ/अल्कोहोल सस्पेंशन, कारण अल्कोहोल कमी तापमानात सर्व एन्झाइमॅटिक क्रियाकलापांना प्रतिबंधित करते.

9. जेव्हा केशन्स (Ca, Mg) मध्ये हे आयन असतात, तेव्हा 80C वर 5 मिनिटे गरम केल्याने RNA क्लीव्ह होईल, त्यामुळे RNA गरम करणे आवश्यक असल्यास, संरक्षण द्रावणामध्ये चेलेटिंग एजंट (1mM सोडियम सायट्रेट, pH 6.4) असणे आवश्यक आहे.

10. त्यानंतरच्या प्रयोगांमध्ये वापरलेले एन्झाईम RNase द्वारे दूषित असू शकतात.

RNA काढण्यासाठी 10 टिपा

1: RNase क्रियाकलाप त्वरीत प्रतिबंधित करा.संकलनानंतर नमुने त्वरीत गोठवले जातात आणि RNase lysis दरम्यान जलद ऑपरेशनद्वारे निष्क्रिय केले जाते.

2: उच्च राइबोझाइम सामग्री असलेल्या ऊतींसाठी योग्य निष्कर्षण पद्धत निवडा आणि ऍडिपोज टिश्यूसाठी फिनॉल असलेली पद्धत वापरणे चांगले.

3: अंदाज गुणवत्तेसाठी नॉर्दर्न आवश्यक आहे, cDNA लायब्ररीच्या बांधकामासाठी उच्च अखंडता आवश्यक आहे आणि RT-PCR आणि RPA (रिबोन्यूक्लीज संरक्षण परख) उच्च अखंडतेची आवश्यकता नाही.RT-PCR ला उच्च शुद्धता (एंझाइम इनहिबिटर अवशेष) आवश्यक आहे.

4: उत्‍पन्‍न सुधारण्‍यासाठी आणि ऱ्हास कमी करण्‍याची गुरुकिल्ली आहे कसून एकरूपीकरण.

5: RNA इलेक्ट्रोफोरेसीस डिटेक्शनची अखंडता तपासा, 28S: 18S = 2: 1 हे पूर्ण चिन्ह आहे, 1:1 हे बहुतेक प्रयोगांसाठी देखील स्वीकार्य आहे.

6: RT-PCR साठी DNA काढणे, अॅरे विश्लेषण DNA काढण्यासाठी Dnase I वापरणे उत्तम.

7: एक्सोजेनस एन्झाईम्सची दूषितता कमी करा - एंजाइम बाहेरून आयात केले जाऊ शकत नाहीत.

8: कमी-सांद्रता न्यूक्लिक अॅसिड केंद्रित करताना, एक सह-पर्जन्य अभिकर्मक जोडला पाहिजे.परंतु एन्झाईम्स आणि डीएनए दूषित होणा-या सह-प्रक्षेपकांना प्रतिबंध करण्यासाठी.

9: आरएनए पूर्णपणे विरघळवा, आवश्यक असल्यास, 5 मिनिटे 65C वर गरम करा.

योग्य स्टोरेज पद्धत

ते -20C वर थोड्या काळासाठी आणि -80C वर जास्त काळ साठवले जाऊ शकते.RNA उत्पन्न सुधारण्याची पहिली पायरी म्हणजे वेगवेगळ्या नमुन्यांमधील RNA सामग्री मोठ्या प्रमाणात बदलते हे लक्षात घेणे.उच्च विपुलता (2-4ug/mg) जसे की यकृत, स्वादुपिंड, हृदय, मध्यम विपुलता (0.05-2ug/mg) जसे की मेंदू, गर्भ, मूत्रपिंड, फुफ्फुस, थायमस, अंडाशय, कमी विपुलता (<0.05ug/mg) mg) जसे की मूत्राशय, हाडे, चरबी.

1: RN सोडण्यासाठी Lyse पेशी - RNA सोडले नाही तर, उत्पन्न कमी होईल.इलेक्ट्रिक होमोजेनायझेशन इतर एकसंध पद्धतींपेक्षा चांगले कार्य करते, परंतु द्रव नायट्रोजन मॅशिंग, एंजाइमॅटिक पचन (लायसोझाइम/लिटिकेस) यासारख्या इतर पद्धतींसह देखील एकत्र करणे आवश्यक आहे.

2: निष्कर्षण पद्धतीचे ऑप्टिमायझेशन.फिनॉल-आधारित पद्धतींमधील सर्वात मोठी समस्या म्हणजे अपूर्ण स्तरीकरण आणि आंशिक RNA नुकसान (सुपरनॅटंट पूर्णपणे काढून टाकता येत नाही).अपूर्ण स्तरीकरण उच्च न्यूक्लिक अॅसिड आणि प्रथिने सामग्रीमुळे होते, जे वापरलेल्या लाइसेटचे प्रमाण वाढवून किंवा नमुन्याचे प्रमाण कमी करून सोडवले जाऊ शकते.ऍडिपोज टिश्यूमध्ये क्लोरोफॉर्म निष्कर्षणाची एक पायरी जोडली गेली.आरएनए नुकसान बॅक-पंपिंगद्वारे किंवा सेंट्रीफ्यूगेशन नंतर सेंद्रिय स्तर काढून टाकून कमी केले जाऊ शकते.कॉलम सेंट्रीफ्यूगेशन-आधारित पद्धतींची सर्वात मोठी समस्या म्हणजे जास्तीचा नमुना.

क्लासिक एक्सट्रॅक्शन टिपा

1. फिनॉल शुद्धीकरण: 1:1 फिनॉल/क्लोरोफॉर्मच्या समान प्रमाणात घाला आणि 1-2 मिनिटे जोमाने मिसळा.2 मिनिटांसाठी उच्च वेगाने सेंट्रीफ्यूज करा.सुपरनाटंट (80-90%) काळजीपूर्वक काढून टाका.मध्यम स्तरावर कधीही जाऊ नका.फिनॉल/क्लोरोफॉर्ममध्ये रिअॅक्शन सोल्यूशनची समान मात्रा जोडली जाऊ शकते आणि सुपरनाटंट काढून टाकले जाऊ शकते.उत्पन्न सुधारण्यासाठी न्यूक्लिक अॅसिड पर्जन्यासाठी दोन सुपरनॅटंट्स एकत्र मिसळले जाऊ शकतात.मिसळताना खूप सौम्य होऊ नका आणि सर्व सुपरनॅटंट काढून टाकण्याचा प्रयत्न करू नका.

2. 70-80% इथेनॉलने धुणे: धुताना, उरलेले मीठ धुतले जाईल याची खात्री करण्यासाठी न्यूक्लिक अॅसिड निलंबित करणे आवश्यक आहे.त्याच वेळी, इथेनॉल ओतल्यानंतर लगेच, काही सेकंदांसाठी उच्च वेगाने सेंट्रीफ्यूज करा आणि नंतर विंदुकाने उरलेले इथेनॉल काढून टाका.खोलीच्या तपमानावर 5-10 मिनिटे उभे राहिल्यानंतर विरघळवा.

11. विशेष संस्था काढणे

1. तंतुमय ऊतक: हृदय/कंकाल स्नायू सारख्या तंतुमय ऊतकांमधून आरएनए काढण्याची गुरुकिल्ली म्हणजे ऊती पूर्णपणे विस्कळीत करणे.या ऊतींमध्ये पेशींची घनता कमी असते, त्यामुळे ऊतींच्या प्रति युनिट वजनासाठी आरएनएचे प्रमाण कमी असते आणि शक्य तितकी प्रारंभिक रक्कम वापरणे चांगले.अतिशीत परिस्थितीत टिशू पूर्णपणे बारीक करून घ्या.

2. प्रथिने/चरबीचे प्रमाण जास्त असलेले ऊती: मेंदू/भाज्यांमध्ये चरबीचे प्रमाण जास्त असते.PCI निष्कर्षणानंतर, सुपरनॅटंटमध्ये पांढरे फ्लोक्युल्स असतात.क्लोरोफॉर्मसह सुपरनॅटंट पुन्हा काढणे आवश्यक आहे.

3. उच्च न्यूक्लिक अॅसिड/रायबोझाइम सामग्रीसह ऊती: प्लीहा/थायमसमध्ये उच्च न्यूक्लिक अॅसिड आणि रायबोझाइम सामग्री असते.अतिशीत स्थितीत मेदयुक्त पीसणे आणि त्यानंतर जलद एकजिनसीपणामुळे राइबोझाइम प्रभावीपणे निष्क्रिय होऊ शकतात.तथापि, जर लाइसेट खूप चिकट असेल (उच्च न्यूक्लिक अॅसिड सामग्रीमुळे), PCI निष्कर्षण प्रभावीपणे स्तरीकरण करण्यास सक्षम होणार नाही;अधिक lysate जोडल्याने या समस्येचे निराकरण होऊ शकते.एकाधिक PCI निष्कर्षण अधिक अवशिष्ट DNA काढू शकतात.अल्कोहोल घातल्यानंतर लगेच पांढरा अवक्षेपण तयार झाल्यास, ते डीएनए दूषित असल्याचे सूचित करते.विरघळल्यानंतर अम्लीय PCI सह पुन्हा काढल्यास DNA दूषितता दूर होऊ शकते.

4. वनस्पती ऊती: वनस्पती ऊती प्राण्यांच्या ऊतीपेक्षा अधिक जटिल असतात.साधारणपणे, वनस्पती द्रव नायट्रोजन परिस्थितीत जमिनीवर असतात, त्यामुळे अंतर्जात एन्झाईम्सद्वारे आरएनए ऱ्हास असामान्य आहे.जर निकृष्टतेची समस्या सोडवली गेली नाही तर, हे जवळजवळ निश्चितपणे नमुन्यात असलेल्या अशुद्धतेमुळे होते.बर्‍याच वनस्पतींमध्ये असलेल्या अशुद्धतेमुळे अवशेष निर्माण होतात आणि अवशेषांचे कारण बहुतेकदा असे असते कारण या अशुद्धींमध्ये RNA बरोबर काही साम्य असते: तुम्ही अवक्षेपण करता आणि मी अवक्षेपित करतो आणि तुम्ही शोषून घेतो आणि मी शोषतो.ही वैशिष्ट्ये निर्धारित करतात की ते खूप मजबूत एन्झाइम अवरोधक आहेत.

सध्या, व्यावसायिक आरएनए एक्सट्रॅक्शन अभिकर्मक लहान समायोजनांसह जवळजवळ सर्व प्राण्यांच्या ऊतींमध्ये रुपांतरित केले जाऊ शकतात, परंतु काही व्यावसायिक आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक आहेत जे बहुतेक वनस्पतींच्या ऊतींसाठी योग्य असू शकतात.सुदैवाने, Foregene विशेष प्रदान करू शकतावनस्पती आरएनए निष्कर्षण किट, आमच्याकडे आहेप्लांट टोटल आरएनए आयसोलेशन किट, प्लांट टोटल आरएनए आयसोलेशन किट प्लस.नंतरचे विशेषतः उच्च पॉलिसेकेराइड आणि पॉलिफेनॉल सामग्री असलेल्या वनस्पतींसाठी डिझाइन केलेले आहे.RNA निष्कर्षणासाठी, प्रयोगशाळेतील वापरकर्त्यांकडून अभिप्राय विशेषतः चांगला आहे.

12. नमुना गोठवण्याचा आणि वितळण्याचा परिणाम गोठलेला नमुना मोठा असू शकतो आणि RNA काढण्यासाठी वापरण्यापूर्वी तो कापला जाणे आवश्यक आहे.कापताना नमुने वितळतात (शक्यतो अंशतः).RNA काढण्याआधी गोठलेल्या नमुन्यांचे वजन करणे आवश्यक असू शकते आणि या प्रक्रियेदरम्यान विरघळणे निश्चितपणे होईल.कधीकधी, द्रव नायट्रोजन मिलिंग प्रक्रियेदरम्यान नमुना वितळणे देखील होते;किंवा फ्रोझन नमुना लिक्विड नायट्रोजन मिलिंगशिवाय थेट लायसेटमध्ये जोडला जातो आणि पूर्ण एकजिनसीपणापूर्वी विरघळणे निश्चितपणे होईल.प्रयोगांनी दर्शविले आहे की गोठलेल्या ऊतींना ताज्या ऊतींपेक्षा वितळताना आरएनए ऱ्हास होण्याची अधिक शक्यता असते.संभाव्य कारण: फ्रीझ-थॉ प्रक्रियेमुळे सेलमधील संरचना विस्कळीत होतात, ज्यामुळे अंतर्जात एन्झाईम्स RNA च्या थेट संपर्कात येणे सोपे होते.

13. RNA गुणवत्तेचा निर्णय सहसा, इलेक्ट्रोफोरेसीसचा वापर RNA च्या अखंडतेचा न्याय करण्यासाठी केला जातो आणि A260/A280 RNA च्या शुद्धतेचा न्याय करण्यासाठी वापरला जातो.सिद्धांतानुसार, अखंड RNA चे प्रमाण 28S:18S = 2.7:1 आहे आणि बहुतेक डेटा 28S:18S = 2:1 च्या गुणोत्तरावर जोर देतात.वस्तुस्थिती अशी आहे की पेशींव्यतिरिक्त इतर नमुन्यांमधून काढलेले जवळजवळ कोणतेही RNA 2:1 गुणोत्तरात नाहीत (हे Agilent Bioanalyzer वापरून प्राप्त झाले होते).

RNA चे इलेक्ट्रोफोरेसीस परिणाम दुय्यम संरचना, इलेक्ट्रोफोरेसीस परिस्थिती, नमुना लोड, EB द्वारे संपृक्ततेची डिग्री इत्यादींसह अनेक घटकांमुळे प्रभावित होतात. RNA शोधण्यासाठी मूळ इलेक्ट्रोफोरेसीस वापरा आणि नियंत्रण म्हणून DNA मार्कर वापरा.2kb वर 28S आणि 0.9kb वर 18S स्पष्ट असल्यास, आणि 28S: 18S > 1, अखंडता नंतरच्या बहुतेक प्रयोगांच्या आवश्यकता पूर्ण करू शकते.

A260/A280 हा एक सूचक आहे ज्यामुळे खूप गोंधळ झाला आहे.सर्व प्रथम, न्यूक्लिक अॅसिडसाठी या निर्देशकाचा मूळ अर्थ स्पष्ट करणे आवश्यक आहे: शुद्ध आरएनए, त्याचे A260/280 = सुमारे 2.0.शुद्ध RNA हे 'कारण' आहे आणि A260/A280 = 2 हा 'प्रभाव' आहे.आता प्रत्येकजण A260/A280 हे 'कारण' म्हणून वापरत आहे, असा विचार करत आहे की “जर A260/A280 = 2 असेल तर RNA शुद्ध आहे”, ज्यामुळे स्वाभाविकपणे गोंधळ होतो.

तुम्हाला स्वारस्य असल्यास, तुम्ही तुमच्या RNA नमुन्यात फिनॉल, ग्वानिडीन आयसोथियोसायनेट, PEG, इत्यादी सारखे थोडेसे अभिकर्मक जोडू शकता, ज्याचा वापर काढण्यासाठी केला जातो आणि नंतर A260/A280 प्रमाण मोजा.वास्तविकता अशी आहे की RNA काढण्यासाठी वापरलेले अनेक अभिकर्मक, तसेच नमुन्यातील अनेक अशुद्धता, A260 आणि A280 च्या आसपास शोषून घेतात, ज्यामुळे A260/A280 वर परिणाम होतो.

200-300 nm श्रेणीतील RNA नमुने स्कॅन करणे हा सध्याचा सर्वात उपदेशात्मक दृष्टीकोन आहे.शुद्ध RNA च्या वक्र मध्ये खालील वैशिष्ट्ये आहेत: वक्र गुळगुळीत आहे, A230 आणि A260 हे दोन वळण बिंदू आहेत, A300 0 च्या जवळ आहे, A260/A280 = सुमारे 2.0, आणि A260/A230 = सुमारे 2.0.स्कॅन डेटा उपलब्ध नसल्यास, A260/A230 गुणोत्तर देखील निर्धारित केले जाणे आवश्यक आहे, कारण हे प्रमाण एन्झाइमॅटिक प्रतिक्रिया प्रभावित करणार्‍या सर्व अशुद्धतेच्या वहनासाठी अधिक संवेदनशील आहे.डिव्हाइसची रेखीय श्रेणी विचारात घ्या (A260 साठी 0.1–0.5).

आणखी दोन उपयुक्त घटना आहेत: जेव्हा A260/A280 पाण्यात मोजले जाते तेव्हा प्रमाण सुमारे 0.3 कमी असेल;तर 10 mM EDTA मध्ये मोजलेले गुणोत्तर 1 mM EDTA मध्ये मोजले गेलेल्या प्रमाणापेक्षा सुमारे 0.2 जास्त आहे.

संबंधित उत्पादने:

चायना प्लांट टोटल आरएनए आयसोलेशन किट उत्पादक आणि पुरवठादार |Foregene (foreivd.com)

आरएनए अलगाव मालिका पुरवठादार आणि कारखाना |चीन आरएनए अलगाव मालिका उत्पादक (foreivd.com)

RNA पृथक्करण मालिका – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)