RT-qPCR प्रयोगामध्ये RNA निष्कर्षण आणि गुणवत्तेचे मूल्यांकन, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन आणि qPCR तीन टप्पे समाविष्ट आहेत, प्रत्येक चरणात बरीच सावधगिरी आहे, आम्ही खाली तपशीलवार परिचय करून देऊ.

Ⅰआरएनए गुणवत्ता मूल्यांकन

RT-qPCR प्रयोगामध्ये, RNA निष्कर्षण पूर्ण झाल्यानंतर, RNA च्या गुणवत्तेचे मूल्यमापन करणे आवश्यक आहे आणि पाठपुरावा प्रयोग तो पात्र झाल्यानंतरच केला जाऊ शकतो.मूल्यमापन पद्धतींमध्ये स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, एजिलेंट जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस, एजिलेंट 2100 विश्लेषण यांचा समावेश आहे, ज्यामध्ये सर्वात सामान्यपणे वापरले जाणारे स्पेक्ट्रोफोटोमीटर आणि अॅग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस पद्धत शोधणे.हे लक्षात घेतले पाहिजे की या दोन पद्धतींचा RNA एकाग्रता, शुद्धता आणि अखंडता तपासण्यासाठी आणि विश्लेषण पूर्ण करण्यासाठी एकत्रितपणे वापरणे आवश्यक आहे, जेणेकरून RNA ची गुणवत्ता सुनिश्चित होईल.

संबंधित आरएनए अलगाव किट: 

सेल टोटल आरएनए अलगाव किट

उच्च शुद्ध आणि उच्च दर्जाचे एकूण आरएनए विविध संवर्धित पेशींमधून 11 मिनिटांत मिळू शकते.

प्राणी एकूण आरएनए अलगाव किट

विविध प्राण्यांच्या ऊतींमधून जलद आणि कार्यक्षमतेने उच्च-शुद्धता आणि उच्च-गुणवत्तेचे एकूण आरएनए काढा.

स्पेक्ट्रोफोटोमीटर:

स्पेक्ट्रोफोटोमीटरचा वापर प्रामुख्याने आरएनएची एकाग्रता आणि शुद्धता निश्चित करण्यासाठी केला जातो, परंतु तो आरएनए आणि जीनोमिक अवशेषांची अखंडता शोधू शकत नाही.त्यापैकी, A260/280 आणि A260/230 हे RNA शुद्धता शोधण्याचे महत्त्वाचे मापदंड आहेत आणि RNA शुद्धता त्यांच्या मूल्यांच्या चढउतारानुसार शोधली जाऊ शकते:

1. 1.9< A260/280< 2.1, RNA शुद्धता चांगली असल्याचे सूचित करते;A260/280<1.9, RNA मध्ये प्रथिनांचे अवशेष असू शकतात असे सूचित करते;A260/280>2.1, RNA चे संभाव्य आंशिक र्‍हास दर्शविते, ज्याची पुष्टी अॅग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसद्वारे केली जाऊ शकते.

2. 2.0< A260/230< 2.2, RNA शुद्धता चांगली असल्याचे सूचित करते;A260/230< 2.0, RNA मध्ये सेंद्रिय अभिकर्मकांचे अवशेष असू शकतात, जसे की फिनॉल, इथेनॉल किंवा शर्करा.

ऍगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस:

Agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस परख RNA अखंडता, जीनोम आणि प्रथिने अवशेषांचे विश्लेषण करू शकते, परंतु RNA च्या एकाग्रतेचे अचूक प्रमाण किंवा सेंद्रिय अभिकर्मकांचे अवशेष शोधू शकत नाही.उदाहरणार्थ युकेरियोटिक आरएनए टेम्पलेट्स घ्या:

1. आरएनए ऍग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसच्या अधीन होते.जर जेल नकाशावर 28sRNA, 18sRNA आणि 5.8sRNA चे फक्त तीन सिंगल बँड असतील तर ते सूचित करते की काढलेला RNA अखंड आहे.ड्रॅगिंग इंद्रियगोचर असल्यास, हे आरएनएचे आंशिक ऱ्हास सूचित करते.

2. ग्लू होल आणि 28sRNA बँड यांच्यामध्ये एकच तेजस्वी बँड असल्यास, जीनोमिक डीएनए अवशेष असू शकतात.

3. जर गोंदाच्या छिद्रामध्ये पट्ट्या दिसल्या, तर हे सूचित करते की प्रथिने आणि इतर मॅक्रोमोलेक्युलर पदार्थांचे अवशेष असू शकतात.

Ⅱ. उलट प्रतिलेखन

RNA निष्कर्षण पूर्ण झाल्यानंतर, त्यानंतरच्या प्रयोगांसाठी ते cDNA मध्ये उलट करणे आवश्यक आहे, म्हणून उलट पाऊल आवश्यक आहे.रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस आणि प्राइमरच्या निवडीतून रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन सादर केले जाईल:

उलट ट्रान्सक्रिप्टेस निवड:

ठराविक रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसमध्ये AMV RTase आणि MMLV RTase यांचा समावेश होतो.AMV RTase च्या RNase H मध्ये मजबूत क्रियाकलाप, लहान संश्लेषण लांबी, कमी संश्लेषण प्रमाण आणि चांगली थर्मल स्थिरता (42 ~ 55℃) आहे.MMLV RTase ची RNase H क्रियाकलाप कमकुवत आहे, संश्लेषण लांबी लांब आहे, संश्लेषण प्रमाण जास्त आहे आणि थर्मल स्थिरता खराब आहे (37 ~ 42℃).

कारण RNase H एंझाइममध्ये RNA टेम्पलेट खराब करण्याचे कार्य आहे, कमकुवत RNase H क्रियाकलाप असलेले MMLV हे रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन दरम्यान प्राधान्याने निवडले पाहिजे आणि नंतर अनुवांशिक अभियांत्रिकी नंतर, MMLV ची थर्मल स्थिरता गुणात्मक झेप गाठली आहे.फोरजीन घेणेForeasy Reverse Transcriptase (रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनसाठी M-MLV) उदाहरण म्हणून, अनुवांशिक पुनर्संयोजन तंत्रज्ञानाचा वापर करून ई. कोलाय इंजिनिअर्ड बॅक्टेरियामध्ये व्यक्त केलेला हा एक नवीन रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस आहे.हे एक रीकॉम्बिनंट डीएनए पॉलिमरेझ आहे जे सिंगल-स्ट्रँडेड RNA, DNA किंवा RNA:DNA हायब्रिडपासून पूरक DNA स्ट्रँडचे संश्लेषण करते.यात RNase H क्रियाकलाप, मजबूत स्थिरता, मजबूत RNA आत्मीयता आणि उच्च शोध संवेदनशीलता नाही.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनसाठी M-MLV)

प्राइमरची निवड:

सामान्यतः RT प्राइमर्स तीन श्रेणींमध्ये मोडतात: oligo dT, यादृच्छिक प्राइमर्स आणि जनुक-विशिष्ट प्राइमर्स.वेगवेगळ्या प्रायोगिक आवश्यकतांनुसार वापरण्यासाठी योग्य प्राइमर्स निवडा.

1. जर टेम्पलेट युकेरियोटिक मूळचा असेल आणि उशीरा cDNA नियमित पीसीआर प्रवर्धनासाठी वापरला असेल, तर Oligo (dT) ची शिफारस केली जाते;त्यानंतरचा प्रयोग फक्त qPCR साठी वापरल्यास, उलट प्रतिलेखनाची कार्यक्षमता सुधारण्यासाठी ऑलिगो (dT) यादृच्छिक प्राइमर्समध्ये मिसळण्याची शिफारस केली जाते.

2. टेम्प्लेट प्रोकॅरिओट्सचे असल्यास, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनसाठी रँडम प्राइमर्स किंवा जनुक विशिष्ट प्राइमर्स निवडले पाहिजेत.

Ⅲ.qPCR

फ्लोरोसेन्स क्वांटिफिकेशन मुख्यत्वे परिमाणात्मक पद्धती, प्राइमर डिझाइन तत्त्वे, ROX निवड, प्रतिक्रिया प्रणाली कॉन्फिगरेशन आणि प्रतिक्रिया परिस्थिती सेटिंग इत्यादींच्या निवडीवरून स्पष्ट केले जाते.

परिमाणात्मक पद्धतींची निवड:

परिमाणवाचक पद्धती सापेक्ष परिमाणवाचक पद्धती आणि परिपूर्ण परिमाणात्मक पद्धतींमध्ये विभागल्या जातात.जनुक अभिव्यक्तीवर विशिष्ट उपचार पद्धतींचा प्रभाव शोधण्यासाठी, वेगवेगळ्या वेळी जनुक अभिव्यक्तीचा फरक शोधण्यासाठी आणि वेगवेगळ्या ऊतकांमधील जनुक अभिव्यक्तीच्या फरकाची तुलना करण्यासाठी सापेक्ष परिमाणीकरण वापरले जाऊ शकते.निरपेक्ष प्रमाणीकरण विषाणूमध्ये न्यूक्लिक अॅसिडचे प्रमाण शोधू शकते आणि याप्रमाणे.प्रयोग करताना, आपण आपल्या स्वतःच्या प्रयोगांनुसार योग्य परिमाणवाचक पद्धती निवडल्या पाहिजेत.

प्राइमर डिझाइनची तत्त्वे:

qPCR साठी प्राइमरची रचना थेट प्रवर्धन कार्यक्षमता आणि उत्पादनाच्या विशिष्टतेशी संबंधित आहे.त्यामुळे, चांगल्या प्राइमर्सची योग्य रचना करणे ही यशस्वी qPCR ची पहिली पायरी आहे.प्राइमरच्या डिझाइनमध्ये, पारंपारिक प्राइमर डिझाइनच्या तत्त्वाची पूर्तता करताना खालील तत्त्वांकडे लक्ष दिले पाहिजे:

1. लक्ष्य तुकड्याची लांबी 100 आणि 300 bp दरम्यान नियंत्रित केली जाते;

2. जीनोमिक डीएनएचा प्रभाव टाळण्यासाठी क्रॉस-एक्सॉन डिझाइन;

3. प्रवर्धन कार्यक्षमतेसाठी डिझाइन केलेल्या प्राइमर्सची चाचणी करणे आवश्यक आहे आणि जेव्हा प्रवर्धन कार्यक्षमता मानक (90-110%) पर्यंत पोहोचते तेव्हाच ते परिमाणात्मक प्रयोगांसाठी वापरले जाऊ शकतात;

4. प्राइमर एकाग्रता सामान्यतः 0.1uM आणि 1.0uM दरम्यान ऑप्टिमाइझ केली जाते.

ची निवडROX:

परिमाणात्मक प्रतिक्रियेच्या प्रक्रियेत, ROX ऑप्टिकल पथ फरक, पाइपिंग त्रुटी किंवा बाष्पीभवन आणि संक्षेपणामुळे होणारा आवाज फरक समान रीतीने समायोजित करू शकते, परिणामांची पुनरावृत्तीक्षमता सुधारते.तथापि, हे लक्षात घ्यावे की ROX ची निवड इन्स्ट्रुमेंटशी संबंधित आहे.जर qPCR इन्स्ट्रुमेंटमध्ये छिद्रांमधील फरक आपोआप दुरुस्त करण्याचे कार्य असेल, तर त्याला ROX जोडण्याची आवश्यकता नाही;अन्यथा, त्याला ROX सुधारणा जोडणे आवश्यक आहे.अभिकर्मक खरेदी करताना लहान भागीदार योग्य ROX निवडण्यासाठी वापरलेल्या साधनानुसार असणे आवश्यक आहे, नंतरच्या चुका टाळा.

प्रतिक्रिया प्रणालीची तयारी:

20ul आणि 50ul च्या प्रतिक्रिया खंडांना प्राधान्य दिले जाते.प्रणाली तयार करताना खालील बाबींवर लक्ष दिले पाहिजे:

1. अल्ट्रा-क्लीन वर्कबेंचमध्ये वेंटिलेशनद्वारे प्रतिक्रिया प्रणाली तयार करणे आवश्यक आहे, नवीन ddH₂प्रत्येक प्रयोगासाठी ओ वापरला जातो;

2. प्रणालीमध्ये प्रदूषण आहे की नाही हे सत्यापित करण्यासाठी प्रत्येक प्रयोगासाठी NTC तयार करणे आवश्यक आहे आणि सिस्टम तयार करताना प्रत्येक प्राइमर्सच्या जोडीने NTC करणे आवश्यक आहे;

3. आरएनए टेम्पलेटमध्ये जीडीएनए अवशेष आहेत की नाही हे शोधण्यासाठी, प्रत्येक नमुन्यासाठी एनआरटी शोधण्यासाठी तयार केले जाऊ शकते;

4. सिस्टम तयार करताना, एका नमुन्यासाठी किमान 3 तांत्रिक पुनरावृत्ती करण्याची शिफारस केली जाते;

5. टेम्प्लेट cDNA असताना, qPCR प्रयोगावर रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन सिस्टमचा प्रतिबंधात्मक प्रभाव कमी करण्यासाठी 5-10 वेळा पातळ करण्याची शिफारस केली जाते.ग्रेडियंटनुसार टेम्पलेट प्रमाण एक्सप्लोर करणे चांगले आहे, जेणेकरून सीटी मूल्य 20-30 च्या दरम्यान येईल;

6. आवश्यक प्रतिक्रियांची संख्या निश्चित करा, प्रतिक्रियांच्या संख्येच्या आधारावर 5-10% वाढवा आणि व्हॉल्यूम कॉन्फिगरेशन क्रमांकाची गणना करा;

7, प्रणाली प्रीमिक्स तत्त्व वापरून तयार केली जाते, सेंट्रीफ्यूगेशन नंतर मिसळते आणि फुगे नाहीत याची खात्री करा;

8, शक्यतो सहाय्यक उपभोग्य वस्तू निवडणे.

संबंधित RT-qPCR किट