शोधण्याची विशिष्टता

बहुतेक प्रकरणांमध्ये, प्राइमर डिझाइनचा उद्देश पीसीआरची विशिष्टता वाढवणे आहे.हे अनेक व्हेरिएबल्सच्या कमी-अधिक अंदाजे प्रभावाद्वारे निर्धारित केले जाते.एक महत्त्वाचा व्हेरिएबल म्हणजे प्राइमरच्या 3′शेवटचा क्रम.

महत्त्वाचे म्हणजे, विशिष्टतेसाठी डिझाइन केलेले पीसीआर अॅसेस विस्तृत डायनॅमिक श्रेणीमध्ये उच्च कार्यक्षमता राखण्याची अधिक शक्यता असते, कारण परख विशिष्ट नसलेल्या अॅम्प्लीफिकेशन उत्पादने तयार करत नाही, ज्यामुळे पीसीआर अभिकर्मकांशी स्पर्धा होते किंवा मुख्य प्रवर्धन प्रतिक्रिया रोखते.

अर्थात, काही प्रकरणांमध्ये, विशिष्टता सर्वात महत्वाची नसते, उदाहरणार्थ, जेव्हा लक्ष्य जवळून संबंधित परंतु भिन्न रोगजनकांचे प्रमाण ठरवणे असते, तेव्हा विशेष रचना, ऑप्टिमायझेशन आणि सत्यापन मानके आवश्यक असतात.

वितळणे वक्र ही एम्प्लिकॉनच्या विशिष्टतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी एक मानक पद्धत आहे, किमान एक लक्ष्य वाढवायचे की नाही या दृष्टीने.तथापि, यावर जोर देणे आवश्यक आहे की वितळणारे वक्र दिशाभूल करणारे असू शकतात कारण, उदाहरणार्थ, ते सबऑप्टिमल प्राइमर्स आणि कमी टेम्प्लेट एकाग्रतेच्या एकत्रित परिणामांमुळे प्रभावित होऊ शकतात.

P5 |वितळणारा वक्र दोन लक्ष्यित DNA च्या वेगवेगळ्या प्रमाणांच्या दोन शोधांमधून प्राप्त Tm शिफ्ट दर्शवितो.

A. उच्च एकाग्रतेवर (ad)), qPCR मापन पूर्ण झाल्यानंतर कोणतेही स्पष्ट प्राइमर डायमर नाही.टेम्प्लेटची एकाग्रता 50 प्रतींपर्यंत (ई) कमी झाल्यामुळे, एक विशिष्ट नसलेले उत्पादन दिसू लागते आणि सर्वात कमी एकाग्रतेवर (f) एकमेव उत्पादन बनते.

B. चाचणीने सर्व लक्ष्य एकाग्रतेवर समान Tms रेकॉर्ड केले आणि सर्वात कमी एकाग्रतेवरही (5 प्रती) कोणतेही स्पष्ट प्राइमर डायमर नव्हते.या दोन शोध पद्धती वापरताना, एनटीसीमध्ये कोणतीही प्रवर्धन उत्पादने आढळली नाहीत.

P5 नमुन्यांसह प्राप्त केलेले विघटन वक्र दर्शविते ज्यामध्ये टेम्पलेट वेगवेगळ्या एकाग्रतेमध्ये उपस्थित आहे.P 5a दर्शविते की दोन सर्वात कमी एकाग्रतेवर, उत्पादित नॉन-विशिष्ट प्रवर्धक उत्पादनांचे Tms विशिष्ट amplicons पेक्षा कमी आहेत.

साहजिकच, कमी एकाग्रतेमध्ये अस्तित्वात असलेले लक्ष्य शोधण्यासाठी ही शोध पद्धत विश्वासार्हपणे वापरली जाऊ शकत नाही.

विशेष म्हणजे, NTCs, म्हणजे, अजिबात DNA नसलेल्या नमुन्यांनी (गैर-विशिष्ट) प्रवर्धन उत्पादनांची नोंद केली नाही, जे दर्शविते की पार्श्वभूमी जीनोमिक डीएनए गैर-विशिष्ट प्रवर्धन/पॉलिमरायझेशनमध्ये भाग घेऊ शकते.

काहीवेळा अशा पार्श्वभूमीचे प्राइमर्स आणि विशिष्ट नसलेले प्रवर्धन यावर उपाय केले जाऊ शकत नाहीत, परंतु कोणत्याही टेम्पलेट एकाग्रता आणि NTC (P 5b) मध्ये गैर-विशिष्ट प्रवर्धन नसलेल्या शोध पद्धतीची रचना करणे शक्य आहे.

येथे, 35 च्या Cq सह लक्ष्य एकाग्रतेचे प्रवर्धन देखील रेकॉर्ड केल्याने एक विशिष्ट विघटन वक्र तयार होईल.त्याचप्रमाणे, NTCs ने विशिष्ट नसलेल्या प्रवर्धनाची कोणतीही चिन्हे दर्शविली नाहीत.काहीवेळा, शोधण्याची वर्तणूक मदर लिकरवर अवलंबून असू शकते आणि विशिष्ट बफर रचनांमध्ये केवळ गैर-विशिष्ट प्रवर्धन आढळून येते, जे भिन्न Mg2+ एकाग्रतेशी संबंधित असू शकते.

शोधण्याची स्थिरता

Ta चे ऑप्टिमायझेशन हे qPCR शोधण्याच्या प्रायोगिक पडताळणी आणि ऑप्टिमायझेशन प्रक्रियेतील एक उपयुक्त पाऊल आहे.हे NTC वाढविल्याशिवाय सर्वात कमी Cq तयार करणारे तापमान (किंवा तापमान श्रेणी) दर्शवून प्राइमर सेटच्या मजबूततेचे थेट संकेत देते.

उच्च mRNA अभिव्यक्ती असलेल्या लोकांसाठी संवेदनशीलतेतील दोन ते चार पट फरक महत्त्वाचा नसू शकतो, परंतु निदान चाचण्यांसाठी, याचा अर्थ सकारात्मक आणि चुकीच्या नकारात्मक परिणामांमधील फरक असू शकतो.

qPCR प्राइमर्सचे Ta गुणधर्म मोठ्या प्रमाणात बदलू शकतात.काही चाचण्या फार मजबूत नसतात, आणि जर त्या प्राइमर्सच्या इष्टतम Ta मूल्याखाली केल्या गेल्या नाहीत तर त्या लवकर कोसळतील.

हे महत्त्वाचे आहे कारण वास्तविक जगात या प्रकारची तपासणी अनेकदा समस्याप्रधान असते आणि नमुन्याची शुद्धता, DNA ची एकाग्रता किंवा इतर DNA ची उपस्थिती इष्टतम असू शकत नाही.

या व्यतिरिक्त, लक्ष्य प्रत क्रमांक विस्तृत श्रेणीत भिन्न असू शकतो आणि अभिकर्मक, प्लास्टिकची भांडी किंवा उपकरणे चाचणी सेट करताना वापरल्या जाणाऱ्यांपेक्षा भिन्न असू शकतात.

P6|तापमान ग्रेडियंट पीसीआर शोधण्याची भिन्न मजबूती दर्शवते.

A. मानवी मेंदूच्या RNA पासून तयार केलेल्या cDNA वर PCR करण्यासाठी Bioline चे Sensifast SYBR मास्टरमिक्स (कॅटलॉग क्रमांक BIO-98050) वापरा.

B. ऍपलीन (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGTGGTGATCTCCTAGG) च्या प्रवर्धन नकाशा आणि विघटन वक्र रेकॉर्ड करण्यासाठी Bio-Rad चे CFX qPCR साधन वापरा.

C. ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG) चा प्रवर्धन आलेख आणि वितळणे वक्र.

D. GFAP चा प्रवर्धन आलेख आणि विघटन वक्र (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCTCGTGGATCTTC).

E. Cqs 7C तापमान ग्रेडियंट अंतर्गत नोंदविलेल्या Cq मधील फरक दाखवून, वेगवेगळ्या ऍनिलिंग तापमानांवर नोंदवले गेले.

P 6 अवांछित चाचणीचा एक विशिष्ट परिणाम दर्शवितो, जिथे qPCR 59C आणि 67C (P 6a) दरम्यान ग्रेडियंट Tas वापरून तीन मानवी मेंदू-विशिष्ट जनुकांसाठी प्राइमर्स वापरून केले गेले.

अॅम्प्लीफिकेशन आलेखावरून असे दिसून येते की ओपलिन प्राइमर्स आदर्शापासून दूर आहेत कारण त्यांची इष्टतम Ta श्रेणी खूपच अरुंद आहे (आकृती 6b), म्हणजेच, Cqs मोठ्या प्रमाणात विखुरलेले आहेत, परिणामी Cqs त्यांच्या इष्टतम Cqs च्या तुलनेत लक्षणीयरीत्या कमी आहेत.

ही शोध पद्धत अस्थिर आहे आणि सबऑप्टिमल प्रवर्धन होऊ शकते.म्हणून, प्राइमर्सची ही जोडी पुन्हा डिझाइन केली पाहिजे.याव्यतिरिक्त, वितळणे वक्र विश्लेषण (इनसेट) दर्शविते की या शोध पद्धतीची विशिष्टता देखील समस्याप्रधान असू शकते, कारण प्रत्येक Ta चे वितळणे वक्र भिन्न आहे.

P 6c मध्ये दर्शविलेली ACSBG1 शोध पद्धत वरील Opalin शोध पद्धतीपेक्षा अधिक मजबूत आहे, परंतु ती अद्याप आदर्शापासून दूर आहे आणि ती सुधारली जाऊ शकते.

तथापि, आम्ही यावर जोर देतो की मजबूतता आणि विशिष्टता यांच्यात आवश्यक कनेक्शन नाही, कारण या शोध पद्धतीद्वारे तयार केलेले विघटन वक्र सर्व टास (इनसेट) मध्ये समान शिखर मूल्य दर्शवते.

दुसरीकडे, P 6d मध्ये दर्शविलेल्या GFAP चाचणीप्रमाणे, बळकटता चाचणी अधिक सहनशील आहे, Tas च्या विस्तृत श्रेणीमध्ये समान Cqs तयार करते.

त्याच 8 अंश सेल्सिअस श्रेणीमध्ये प्राप्त झालेल्या Cqs मधील फरक 1 पेक्षा कमी आहे आणि विघटन वक्र (इनसेट) या तापमान श्रेणीतील शोध वैशिष्ट्यांची पुष्टी करते.हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की गणना केलेले Tas आणि वास्तविक Ta श्रेणी खूप भिन्न असू शकतात.

संशोधकांना कार्यक्षम प्राइमर्स डिझाइन करण्यात मदत करण्यासाठी डिझाइन केलेली अनेक मार्गदर्शक तत्त्वे आहेत, त्यापैकी बहुतेक दीर्घ-स्थापित नियमांवर आधारित आहेत आणि प्राइमर्सच्या 3′एंडवर बरेच लक्ष दिले गेले आहे.3'च्या शेवटी एक G किंवा C आणि दोन G किंवा C बेस (GC क्लॅम्प) समाविष्ट करण्याची शिफारस केली जाते, परंतु शेवटच्या 5 पैकी दोनपेक्षा जास्त नाही.

व्यवहारात, हे नियम संशोधकांना मार्गदर्शन करू शकतात, परंतु ते सर्व परिस्थितीत योग्य असतीलच असे नाही.

P7 |प्राइमरच्या 3′एंडचा विशिष्टता किंवा कार्यक्षमतेवर फारसा प्रभाव पडत नाही.

A. मानवी HIF-1α (NM_181054.2) जनुकासाठी प्राइमर्सची स्थिती.

B. सहा चाचणी वस्तू वाढवण्यासाठी Agilent Brilliant III SYBR ग्रीन मदर लिकर (Cat. No. 600882) वापरा.

C. Bio-Rad च्या CFX qPCR इन्स्ट्रुमेंट आणि 3′एंड प्राइमर्सद्वारे रेकॉर्ड केलेला प्रवर्धन आलेख आणि वितळणारा वक्र.NTC लाल रंगात दर्शविले आहेत.

D. प्रत्येक चाचणी आयटमची Cqs रेकॉर्ड

उदाहरणार्थ, P 7 मधील परिणाम 3′एंड नियमाला विरोध करतो.सर्व डिझाईन्स मूलत: समान परिणाम देतात, फक्त दोन प्राइमर संयोजनांमुळे NTC मध्ये विशिष्ट नसलेले प्रवर्धन होते.

तथापि, आम्ही GC क्लिपच्या प्रभावाचे समर्थन करू शकत नाही, कारण या प्रकरणात, जास्तीत जास्त 30 बेस म्हणून A किंवा T वापरल्याने विशिष्टता कमी होत नाही.

चाचणी C, जेथे F प्राइमर GGCC मध्ये समाप्त होतो, NTCs मध्ये Cqs रेकॉर्ड केले, हे सूचित करते की एखाद्याला 30-एंडवर हे अनुक्रम टाळायचे आहेत.आम्ही यावर जोर देतो की प्राइमर जोडीचा सर्वोत्तम 3′एंड क्रम निश्चित करण्याचा एकमेव मार्ग म्हणजे काही उमेदवार प्राइमर्सचे प्रायोगिकरित्या मूल्यांकन करणे.

प्रवर्धन कार्यक्षमता

महत्त्वाचे म्हणजे, जरी विशिष्ट नसलेले पीसीआर शोध कधीच विशिष्ट होऊ शकत नसले तरी, एन्झाईम, मदर लिकर, अॅडिटीव्ह आणि सायकलिंग परिस्थिती बदलून अॅम्प्लीफिकेशन कार्यक्षमता अनेक वेगवेगळ्या प्रकारे समायोजित आणि वाढवता येते.

पीसीआर शोधण्याच्या कार्यक्षमतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी, लक्ष्य न्यूक्लिक अॅसिडच्या 10 किंवा 5 पट सिरीयल डायल्यूशन वापरणे चांगले आहे, म्हणजेच "मानक वक्र पद्धत".

जर मानक वक्र तयार करण्यासाठी पीसीआर अॅम्प्लिकॉन किंवा सिंथेटिक डीएनए लक्ष्यांचा वापर केला असेल, तर या लक्ष्यांचे अनुक्रमिक डायल्युशन पार्श्वभूमी डीएनए (जसे की जीनोमिक डीएनए) च्या स्थिर प्रमाणात मिसळले जावे.

P8 |PCR च्या कार्यक्षमतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी सौम्य वक्र.

A. HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA आणि R: TGTCCTGTGTGGTGACTTGTCC आणि Agilent's Brilliant III SYBR ग्रीन मास्टरमिक्स (कॅटलॉग क्रमांक 600882) PCR आणि वितळणाऱ्या वक्र स्थितीसाठी प्राइमर्स वापरा.

B. 100 ng RNA उलट लिप्यंतरित केले गेले, 2 वेळा पातळ केले गेले आणि अनुक्रमे पातळ केलेले cDNA नमुने 5 वेळा 1 ng मानवी जीनोमिक डीएनएमध्ये पातळ केले गेले.इनसेटमध्ये वितळण्याची वक्र दर्शविली आहे.

C. दुसऱ्या cDNA नमुन्यासाठी RT प्रतिक्रिया, सौम्यता आणि सिरीयल डायल्युशनची पुनरावृत्ती झाली आणि परिणाम सारखेच होते.

P 8 दोन वेगवेगळ्या cDNA नमुन्यांवर समान शोध पद्धत वापरून दोन मानक वक्र दाखवते, परिणाम समान कार्यक्षमता आहे, सुमारे 100%, आणि R2 मूल्य देखील समान आहे, म्हणजे, प्रायोगिक डेटा आणि प्रतिगमन रेषा किंवा डेटा रेखीयतेची डिग्री यांच्यातील फिटची डिग्री.

दोन मानक वक्र तुलनात्मक आहेत, परंतु अगदी समान नाहीत.उद्दिष्ट अचूकपणे मोजणे हा उद्देश असल्यास, अनिश्चिततेचे स्पष्टीकरण न देता कॉपी क्रमांकाची गणना प्रदान करणे अस्वीकार्य आहे हे लक्षात घेतले पाहिजे.

P9 |प्रमाणित वक्र वापरून परिमाणीकरणाशी संबंधित मापन अनिश्चितता.

A. GAPDH (NM_002046) साठी PCR आणि वितळणाऱ्या वक्र स्थितीसाठी प्राइमर्स वापरा.F: ACAGTTGCCATGTAGACC आणि R: TAACTGGTTGAGCACAGG आणि बायोलाइनचे सेन्सीफास्ट SYBR मास्टरमिक्स (कॅटलॉग क्रमांक BIO-98050).

B. Bio-Rad च्या CFX qPCR इन्स्ट्रुमेंटसह प्रवर्धक चार्ट, वितळणारे वक्र आणि मानक वक्र रेकॉर्ड केलेले.

C. मानक वक्र आलेख आणि 95% आत्मविश्वास मध्यांतर (CI).

D. डायल्युशन वक्रातून मिळालेल्या तीन Cq मूल्यांचा कॉपी क्रमांक आणि 95% आत्मविश्वास मध्यांतर.

P 9 दर्शविते की ऑप्टिमाइझ केलेल्या चाचणीसाठी, एका मानक वक्रची अंतर्निहित परिवर्तनशीलता अंदाजे 2 पट (95% आत्मविश्वास मध्यांतर, किमान ते कमाल) असते, जी अपेक्षा केली जाऊ शकते अशी सर्वात लहान परिवर्तनशीलता असू शकते.

संबंधित उत्पादन:

सेल डायरेक्ट आरटी qPCR किट

माउस टेल डायरेक्ट पीसीआर किट

अॅनिमल टिश्यू डायरेक्ट पीसीआर किट