qPCR प्रयोगांमध्ये, प्राइमर डिझाइन हा देखील एक महत्त्वाचा दुवा आहे.प्राइमर योग्य आहेत की नाही हे प्रवर्धन कार्यक्षमता मानकापर्यंत पोहोचते की नाही, प्रवर्धित उत्पादने विशिष्ट आहेत की नाही आणि प्रायोगिक परिणाम उपलब्ध आहेत की नाही याच्याशी जवळचा संबंध आहे.
मग qPCR प्राइमरची विशिष्टता कशी चांगली करावी?उच्च प्रवर्धन कार्यक्षमता?
आज, आम्‍ही तुम्‍हाला qPCR प्राइमर्स डिझाईन करण्‍यासाठी एकत्र घेऊन जाऊ, आणि qPCR प्राइमर डिझाईन हे प्रयोगांमध्‍ये एक कार्यक्षम विद्या कौशल्य बनू दे.
qPCR प्राइमर्स डिझाइन करताना, सामान्यत: खालील मुद्द्यांकडे लक्ष द्या: प्राइमर्स शक्य तितक्या इंट्रोनमध्ये डिझाइन केले पाहिजेत, उत्पादनाची लांबी 100-300 bp असावी, Tm मूल्य 60°C च्या शक्य तितके जवळ असावे, आणि अपस्ट्रीम आणि डाउनस्ट्रीम प्राइमर्स शक्य तितक्या जवळ असावेत आणि प्राइमरचा शेवट G किंवा C असावा, इत्यादी.
1. इंट्रोन्सवर पसरलेल्या प्राइमर्सची रचना
qPCR प्राइमर्स डिझाइन करताना, इंट्रोनमध्ये डिझाइन केलेले प्राइमर्स निवडल्याने gDNA टेम्प्लेट वाढवण्यापासून प्रतिबंधित केले जाऊ शकते आणि उत्पादने सर्व cDNA च्या प्रवर्धनातून प्राप्त होतात, त्यामुळे gDNA दूषित होण्याचा प्रभाव दूर होतो.
2. प्राइमर लांबी
प्राइमरची लांबी साधारणपणे 18-30 nt च्या दरम्यान असते आणि प्रवर्धक उत्पादनाची लांबी शक्य तितक्या 100-300 bp दरम्यान नियंत्रित केली पाहिजे.
जर प्राइमर खूप लहान असेल तर ते विशिष्ट नसलेल्या प्रवर्धनास कारणीभूत ठरेल आणि जर ते खूप लांब असेल तर ते सहजपणे दुय्यम संरचना (जसे की हेअरपिन स्ट्रक्चर) तयार करेल.प्रवर्धन उत्पादन खूप लांब असल्यास, ते पॉलिमरेझच्या प्रतिक्रियेसाठी योग्य नाही, ज्यामुळे पीसीआर प्रवर्धनाच्या कार्यक्षमतेवर परिणाम होईल.
3. GC सामग्री आणि Tm मूल्य
प्राइमर्सची जीसी सामग्री 40% आणि 60% दरम्यान नियंत्रित केली पाहिजे.जर ते खूप जास्त किंवा खूप कमी असेल तर ते प्रतिक्रिया सुरू करण्यास अनुकूल नाही.समान Tm मूल्य आणि अॅनिलिंग तापमान मिळविण्यासाठी फॉरवर्ड आणि रिव्हर्स प्राइमर्सची GC सामग्री सारखीच असली पाहिजे.
Tm मूल्य शक्यतो 55-65°C च्या दरम्यान असावे, साधारणतः 60°C च्या आसपास, आणि अपस्ट्रीम आणि डाउनस्ट्रीमचे Tm मूल्य शक्य तितके जवळ असावे, शक्यतो 4°C पेक्षा जास्त नसावे.
4. प्राइमरच्या 3′ शेवटी A निवडणे टाळा
जेव्हा प्राइमरचा 3′ शेवट जुळत नाही, तेव्हा वेगवेगळ्या बेसच्या संश्लेषण कार्यक्षमतेमध्ये मोठा फरक असतो.जेव्हा शेवटचा बेस A असतो, तेव्हा तो जुळत नसल्याच्या बाबतीतही साखळी संश्लेषण सुरू करू शकतो आणि जेव्हा शेवटचा आधार T When असतो, तेव्हा विसंगत इंडक्शनची कार्यक्षमता मोठ्या प्रमाणात कमी होते.म्हणून, प्राइमरच्या 3′ शेवटी A निवडणे टाळण्याचा प्रयत्न करा आणि T निवडणे चांगले.
हा प्रोब प्राइमर असल्यास, प्रोबचा 5′ शेवट G असू शकत नाही, कारण एकच G बेस FAM फ्लूरोसंट रिपोर्टर ग्रुपशी जोडलेला असतानाही, G FAM ग्रुपद्वारे उत्सर्जित होणारा फ्लोरोसेंट सिग्नल देखील शांत करू शकतो, परिणामी चुकीचे नकारात्मक परिणाम मिळतात.दिसतात.
5. बेस वितरण
प्राइमरमधील चार बेसचे वितरण शक्यतो यादृच्छिक आहे, 3′ शेवटी 3 पेक्षा जास्त सलग G किंवा C टाळले जाते आणि 3 पेक्षा जास्त सलगG किंवा C हे GC-समृद्ध अनुक्रम क्षेत्रामध्ये पेअरिंग तयार करणे सोपे आहे.
6. प्राइमर डिझाइन प्रदेशाने जटिल दुय्यम संरचना टाळल्या पाहिजेत.
प्रवर्धन उत्पादनाच्या सिंगल स्ट्रँडद्वारे तयार केलेली दुय्यम रचना पीसीआरच्या सुरळीत प्रगतीवर परिणाम करेल.लक्ष्य क्रमात दुय्यम रचना आहे की नाही हे आधीच सांगून, प्राइमर्सच्या डिझाइनमध्ये हा प्रदेश टाळण्याचा प्रयत्न करा.
7. प्राइमर स्वतः आणि प्राइमर दरम्यान सलग पूरक बेस टाळण्याचा प्रयत्न केला पाहिजे.
प्राइमर आणि प्राइमरमध्ये सलग 4 बेस पूरकता असू शकत नाही.प्राइमरमध्ये स्वतःला पूरक क्रम नसावा, अन्यथा ते स्वतःला दुमडून हेअरपिन स्ट्रक्चर तयार करेल, ज्यामुळे प्राइमर आणि टेम्पलेटच्या अॅनिलिंग संयोजनावर परिणाम होईल.
अपस्ट्रीम आणि डाउनस्ट्रीम प्राइमर्समध्ये पूरक अनुक्रम अस्तित्वात असू शकत नाहीत.प्राइमर्समधील पूरकता प्राइमर डायमर तयार करेल, ज्यामुळे PCR कार्यक्षमता कमी होईल आणि परिमाणात्मक अचूकतेवर देखील परिणाम होईल.प्राइमर-डायमर आणि हेअरपिन स्ट्रक्चर्स अपरिहार्य असल्यास, △G मूल्य खूप जास्त नसावे (4.5 kcal/mol पेक्षा कमी असावे).
8. प्राइमर्स लक्ष्य विशिष्ट उत्पादन वाढवतात.
qPCR शोधण्याचे अंतिम लक्ष्य लक्ष्य जनुकाची विपुलता समजून घेणे आहे.गैर-विशिष्ट प्रवर्धन आढळल्यास, परिमाण चुकीचे असेल.म्हणून, प्राइमर्स डिझाइन केल्यानंतर, त्यांची BLAST द्वारे चाचणी करणे आवश्यक आहे आणि उत्पादनांच्या विशिष्टतेची अनुक्रम डेटाबेसमध्ये तुलना केली जाते.
पुढे, qPCR प्राइमर्स डिझाइन करण्यासाठी आम्ही मानवी GAS6 (ग्रोथ अरेस्ट स्पेसिफिक 6) जनुक एक उदाहरण म्हणून घेतो.
01 क्वेरी जीन
होमो GAS6NCBI मार्फतयेथे, आपण जीनचे नाव आणि प्रजाती सुसंगत असल्याची खात्री करण्यासाठी त्यांची तुलना करण्याकडे लक्ष दिले पाहिजे.
02 जनुकांचा क्रम शोधा
(1) लक्ष्य अनुक्रम जीनोमिक डीएनए असल्यास, पहिला निवडा, जो जनुकाचा जीनोमिक डीएनए अनुक्रम आहे.
(2) लक्ष्य क्रम mRNA असल्यास, दुसरा निवडा.प्रविष्ट केल्यानंतर, खालील तक्त्यामध्ये “CDS” वर क्लिक करा.तपकिरी पार्श्वभूमी अनुक्रम हा जनुकाचा कोडिंग क्रम आहे.
03 डिझाईन प्राइमर्स
प्राइमर-ब्लास्ट इंटरफेस प्रविष्ट करा
वरच्या डावीकडे फास्टा फॉरमॅटमध्‍ये जनुक अनुक्रम क्रमांक किंवा अनुक्रम एंटर करा आणि संबंधित पॅरामीटर्स भरा.

"प्राइमर्स मिळवा" वर क्लिक करा आणि NCBI तुम्हाला सांगण्यासाठी पॉप अप करेल की अशा पॅरामीटरची निवड इतर स्प्लिसिंग प्रकारांमध्ये वाढवली जाईल.आम्ही वेगवेगळे स्प्लिसिंग प्रकार तपासू शकतो आणि त्यांना योग्य प्राइमर जोडी मिळवण्यासाठी सबमिट करू शकतो (खालील चित्रात दाखवल्याप्रमाणे).ही प्रक्रिया चालण्यासाठी दहापट सेकंद लागू शकतात.
या प्राइमर जोड्यांचे अॅनिलिंग तापमान ६०°C च्या आसपास असते.प्रयोगाच्या उद्देशानुसार, प्रयोगासाठी मध्यम लांबी, चांगली विशिष्टता आणि कमी स्व-पूरक असलेले प्राइमर्स निवडा आणि यशाचा दर खूप जास्त आहे!
04प्राइमर विशिष्टता पडताळणी
खरं तर, प्राइमर्स डिझाइन करण्याव्यतिरिक्त, प्राइमर-ब्लास्ट आम्ही स्वतः डिझाइन केलेल्या प्राइमर्सचे देखील मूल्यांकन करू शकतो.प्राइमर डिझाइन पृष्ठावर परत या, आम्ही डिझाइन केलेले अपस्ट्रीम आणि डाउनस्ट्रीम प्राइमर्स प्रविष्ट करा आणि इतर पॅरामीटर्स समायोजित केले जाणार नाहीत.सबमिट केल्यानंतर, आपण इतर जीन्सवर प्राइमर्सची जोडी देखील अस्तित्वात आहे की नाही हे पाहू शकता.जर ते सर्व जनुकावर प्रदर्शित केले गेले तर आम्ही वाढवू इच्छितो, हे दर्शविते की या प्राइमरच्या जोडीची विशिष्टता उत्तम आहे!(उदाहरणार्थ, प्राइमर क्वेरीचा हा एकमेव परिणाम आहे!)

05 प्राइमर गुणवत्ता निर्णय
"परिपूर्ण" प्राइमर हा कोणत्या प्रकारचा प्राइमर आहे जो "मानकांपर्यंत प्रवर्धन कार्यक्षमता", "विवर्धित उत्पादन वैशिष्ट्ये" आणि "विश्वसनीय प्रायोगिक परिणाम" एकत्र करतो?
प्रवर्धन कार्यक्षमता

वितळणारा वक्र
प्राइमर्सची प्रवर्धन कार्यक्षमता 90%-110% पर्यंत पोहोचते, याचा अर्थ प्रवर्धन कार्यक्षमता चांगली आहे आणि वितळण्याच्या वक्रमध्ये एकच शिखर आहे आणि सामान्यतः Tm>80°C आहे, याचा अर्थ प्रवर्धन विशिष्टता चांगली आहे.
 
संबंधित उत्पादने:
रिअल टाइम पीसीआर इझी-SYBR ग्रीन I
रिअल टाइम पीसीआर इझी-ताकमान