प्राइमर डिझाइन आधार (99% समस्या सोडवल्या जाऊ शकतात)
1. प्राइमरची लांबी: पाठ्यपुस्तकासाठी 15-30bp आवश्यक असते, साधारणतः 20bp.विशिष्टता सुनिश्चित करण्यासाठी वास्तविक स्थिती 18-24bp असणे चांगले आहे, परंतु जितके जास्त चांगले, खूप लांब प्राइमर देखील विशिष्टता कमी करेल आणि उत्पन्न कमी करेल.
2. प्राइमर अॅम्प्लीफिकेशन स्पॅन: 200-500bp योग्य आहे आणि विशिष्ट परिस्थितीनुसार तुकडा 10kb पर्यंत वाढवता येतो.
3. प्राइमर बेस: G+C ची सामग्री 40-60% असावी, खूप कमी G+C प्रवर्धन प्रभाव चांगला नाही, खूप जास्त G+C गैर-विशिष्ट बँड दिसणे सोपे आहे.एटीजीसी 5 पेक्षा जास्त प्युरीन किंवा पायरीमिडीन न्यूक्लियोटाइड्सचे क्लस्टर टाळून यादृच्छिकपणे वितरित केले जाते.स्थिरता वाढवण्यासाठी 5′ एंड आणि इंटरमीडिएट सीक्वेन्ससाठी मल्टी-gc, 3′ शेवटी रिच GC टाळा, शेवटच्या 3 बेससाठी GC नाही किंवा शेवटच्या 5 पैकी 3 बेससाठी GC नाही.
4. प्राइमर्समध्ये दुय्यम संरचना टाळा आणि दोन प्राइमर्समधील पूरकता टाळा, विशेषत: 3'च्या शेवटी पूरकता, अन्यथा प्राइमर डायमर तयार होईल आणि विशिष्ट नसलेल्या प्रवर्धित बँड तयार होतील.
5. प्राइमर्सच्या 3' टोकावरील तळ, विशेषत: शेवटचे आणि शेवटचे तळ, जोडलेले नसलेल्या टर्मिनल बेसमुळे PCR अपयश टाळण्यासाठी काटेकोरपणे जोडले जावे.
6. प्राइमर्समध्ये योग्य क्लीवेज साइट्स असतात किंवा जोडल्या जाऊ शकतात आणि अॅम्प्लीफाइड टार्गेट सीक्वेन्समध्ये शक्यतो योग्य क्लीवेज साइट्स असणे आवश्यक आहे, जे क्लीवेज विश्लेषण किंवा आण्विक क्लोनिंगसाठी खूप फायदेशीर आहे.
7. प्राइमर्सची विशिष्टता: प्राइमरमध्ये न्यूक्लिक अॅसिड सीक्वेन्स डेटाबेसमधील इतर अनुक्रमांसह स्पष्ट समरूपता नसावी.
8. सॉफ्टवेअर वापरायला शिका: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (हे ऑनलाइन डिझाइन उत्तम काम करते).
उपरोक्त सामग्री कमीतकमी 99% प्राइमर डिझाइन समस्या सोडवू शकते.
प्राइमर डिझाइनचे तपशील नियंत्रित करा
1. प्राइमर लांबी
सामान्य प्राइमर लांबी 18 ~ 30 बेस आहे.सर्वसाधारणपणे, प्राइमरचे एनीलिंग तापमान निर्धारित करणारा सर्वात महत्वाचा घटक म्हणजे प्राइमरची लांबी.प्राइमरचे अॅनिलिंग तापमान सामान्यतः निवडले जाते (Tm मूल्य -5℃), आणि काही थेट Tm मूल्य वापरतात.प्राइमरच्या अॅनिलिंग तापमानाची अंदाजे गणना करण्यासाठी खालील सूत्रांचा वापर केला जाऊ शकतो.
जेव्हा प्राइमरची लांबी 20bp पेक्षा कमी असते: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
जेव्हा प्राइमरची लांबी 20bp पेक्षा जास्त असते: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/लांबी-5℃
याव्यतिरिक्त, अॅनिलिंग तापमानाची गणना करण्यासाठी अनेक सॉफ्टवेअर देखील वापरले जाऊ शकतात, गणना तत्त्व भिन्न असेल, म्हणून कधीकधी गणना केलेल्या मूल्यामध्ये लहान अंतर असू शकते.PCR प्रतिक्रियांना अनुकूल करण्यासाठी, सर्वात लहान प्राइमर जे 54℃ पेक्षा कमी नसलेले तापमान सुनिश्चित करतात ते सर्वोत्तम कार्यक्षमता आणि विशिष्टतेसाठी वापरले जातात.
एकंदरीत, प्राइमरची विशिष्टता प्रत्येक अतिरिक्त न्यूक्लियोटाइडसाठी चार घटकांनी वाढते, ज्यामुळे बहुतेक ऍप्लिकेशन्ससाठी किमान प्राइमर लांबी 18 न्यूक्लियोटाइड्स असते.प्राइमर लांबीची वरची मर्यादा फार महत्वाची नाही, मुख्यतः प्रतिक्रिया कार्यक्षमतेशी संबंधित आहे.एन्ट्रॉपीमुळे, प्राइमर जितका लांब असेल, डीएनए पॉलिमरेझ बांधण्यासाठी स्थिर दुहेरी-अडका टेम्प्लेट तयार करण्यासाठी लक्ष्य डीएनएला जोडण्यासाठी ते कमी दराने जोडते.
प्राइमर्स डिझाइन करण्यासाठी सॉफ्टवेअर वापरताना, प्राइमर्सची लांबी TM मूल्यानुसार निर्धारित केली जाऊ शकते, विशेषत: फ्लूरोसेन्स क्वांटिटेटिव्ह पीसीआरच्या प्राइमर्ससाठी, TM=60℃ किंवा त्यामुळे नियंत्रित केले पाहिजे.
2.GC सामग्री
सामान्यतः, प्राइमरच्या अनुक्रमांमध्ये G+C ची सामग्री 40% ~ 60% असते, आणि GC सामग्री आणि प्राइमर्सच्या जोडीचे Tm मूल्य समन्वयित केले पाहिजे.प्राइमरमध्ये गंभीर GC किंवा AT प्रवृत्ती असल्यास, A, T किंवा G आणि C टेलची योग्य मात्रा प्राइमरच्या 5 'शेवटमध्ये जोडली जाऊ शकते.
3. एनीलिंग तापमान
अॅनिलिंग तापमान अनचेन तापमानापेक्षा 5℃ कमी असावे.प्राइमर बेसची संख्या कमी असल्यास, एनीलिंग तापमान योग्यरित्या वाढवता येते, ज्यामुळे पीसीआरची विशिष्टता वाढू शकते.जर बेसची संख्या मोठी असेल तर, अॅनिलिंग तापमान योग्यरित्या कमी केले जाऊ शकते.4 ℃ ~ 6 ℃ च्या प्राइमर्सच्या जोडीमधील अॅनिलिंग तापमानाचा फरक PCR उत्पन्नावर परिणाम करणार नाही, परंतु आदर्शपणे प्राइमर्सच्या जोडीचे अॅनिलिंग तापमान सारखेच असते, जे 55 ℃ ~ 75 ℃ दरम्यान बदलू शकते.
4. प्रवर्धन टेम्पलेटचे दुय्यम संरचना क्षेत्र टाळा
प्रवर्धित तुकडा निवडताना टेम्प्लेटचा दुय्यम संरचनेचा प्रदेश टाळणे चांगले.टार्गेट फ्रॅगमेंटच्या स्थिर दुय्यम संरचनेचा अंदाज आणि अंदाज संबंधित संगणक सॉफ्टवेअरद्वारे केला जाऊ शकतो, जे टेम्पलेट निवडीसाठी उपयुक्त आहे.प्रायोगिक परिणाम दर्शविते की जेव्हा विस्तारित करावयाच्या प्रदेशाची मुक्त ऊर्जा (△G) 58.6lkJ/mol पेक्षा कमी असते तेव्हा विस्तार अनेकदा अयशस्वी होतो.
5. लक्ष्य DNA सह जुळत नाही
जेव्हा प्रवर्धित लक्ष्य DNA अनुक्रम मोठा असतो, तेव्हा प्राइमर लक्ष्य DNA च्या अनेक भागांना बांधू शकतो, परिणामी परिणामामध्ये अनेक बँड दिसू शकतात.यावेळी BLAST सॉफ्टवेअर चाचणी, वेबसाइट वापरणे आवश्यक आहे:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.दोन क्रम संरेखित करा (bl2seq) निवडा.
झोन 1 मध्ये प्राइमर सीक्वेन्स पेस्ट करणे आणि झोन 2 ला लक्ष्य DNA सीक्वेन्स बदलणे अदलाबदल करण्यायोग्य आहे आणि BLAST पूरक, अँटिसेन्स आणि इतर शक्यतांची गणना करते, त्यामुळे वापरकर्त्यांना दोन्ही चेन सेन्स चेन आहेत की नाही हे लक्षात घेण्याची आवश्यकता नाही.तुम्हाला डेटाबेसमधील अनुक्रमाचा GI क्रमांक माहित असल्यास तुम्ही GI क्रमांक देखील प्रविष्ट करू शकता, त्यामुळे तुम्हाला अनुक्रमाचा मोठा भाग पेस्ट करण्याची गरज नाही.शेवटी, लक्ष्यित DNA मध्ये प्राइमरमध्ये एकाधिक समरूप साइट्स आहेत की नाही हे पाहण्यासाठी 3 वर संरेखित करा क्लिक करा.
6. प्राइमर टर्मिनल
प्राइमरचा 3 'शेवट जेथे विस्तार सुरू होतो तेथून सुरू होणारे विसंगती रोखणे महत्त्वाचे आहे.3' शेवट सलग 3 G किंवा C पेक्षा जास्त नसावा, कारण यामुळे G+C संवर्धन अनुक्रम क्षेत्रामध्ये प्राइमर चुकून ट्रिगर होईल.3 'एंड कोणतीही दुय्यम रचना तयार करू शकत नाही, विशेष PCR (AS-PCR) प्रतिक्रियांशिवाय, प्राइमरचा 3′ शेवट जुळत नाही.उदाहरणार्थ, जर एन्कोडिंग क्षेत्र प्रवर्धित केले असेल, तर प्राइमरचा 3' टोक कोडॉनच्या तिसऱ्या स्थानावर संपुष्टात आणू नये, कारण कोडॉनचे तिसरे स्थान क्षीण होण्याची शक्यता असते, ज्यामुळे प्रवर्धनाची विशिष्टता आणि कार्यक्षमता प्रभावित होईल.एनेक्सेशन प्राइमर्स वापरताना, कोडोन वापर सारणीचा संदर्भ घ्या, जैविक प्राधान्याकडे लक्ष द्या, 3′ शेवटी अॅनेक्सेशन प्राइमर्स वापरू नका आणि जास्त प्रमाणात प्राइमर्स (1uM-3uM) वापरा.
7. प्राइमर्सची दुय्यम रचना
प्राइमरमध्ये स्वतःला पूरक अनुक्रम नसावेत, अन्यथा प्राइमर स्वतःच हेअरपिन स्ट्रक्चर्समध्ये दुमडतील आणि ही दुय्यम रचना स्टेरिक अडथळामुळे प्राइमर्स आणि टेम्पलेट्सच्या बंधनावर परिणाम करेल.कृत्रिम निर्णय वापरल्यास, प्राइमरचे सतत पूरक आधार 3bp पेक्षा जास्त नसावेत.दोन प्राइमर्समध्ये कोणतीही पूरकता असू नये, विशेषत: प्राइमर डायमर तयार होण्यापासून रोखण्यासाठी 3 'एंडचा पूरक ओव्हरलॅप टाळावा.सर्वसाधारणपणे, प्राइमर्सच्या जोडीमध्ये सलग 4 पेक्षा जास्त बेसस होमोलॉजी किंवा पूरकता नसावी.
8. मार्कर किंवा loci जोडा
5 'एंडचा अॅम्प्लीफिकेशन स्पेसिफिकिटीवर थोडासा प्रभाव पडतो आणि त्यामुळे अॅम्प्लीफिकेशन स्पेसिफिकिटीवर परिणाम न करता बदलता येऊ शकतो.प्राइमर 5 'एंडच्या बदलामध्ये समाविष्ट आहे: एन्झाइम प्रतिबंध साइट जोडणे;लेबल केलेले बायोटिन, फ्लूरोसेन्स, डिगॉक्सिन, Eu3+, इ. प्रथिने बंधनकारक DNA अनुक्रम सादर करा;उत्परिवर्तन साइट्स सादर करणे, उत्परिवर्तन अनुक्रम समाविष्ट करणे आणि गहाळ करणे आणि प्रवर्तक अनुक्रमांची ओळख करणे इ. अतिरिक्त तळ प्रवर्धनाच्या कार्यक्षमतेवर कमी-अधिक प्रमाणात परिणाम करतील आणि प्राइमर डायमर तयार होण्याची शक्यता वाढवेल, परंतु पुढील चरणासाठी काही सवलती दिल्या पाहिजेत.लक्ष्य क्रमावर अस्तित्वात नसलेले अतिरिक्त अनुक्रम, जसे की प्रतिबंध साइट आणि प्रवर्तक अनुक्रम, विशिष्टतेवर परिणाम न करता प्राइमरच्या 5′ शेवटी जोडले जाऊ शकतात.हे अनुक्रम प्राइमर Tm मूल्यांच्या गणनेमध्ये समाविष्ट केलेले नाहीत, परंतु पूरकता आणि अंतर्गत दुय्यम संरचनेसाठी चाचणी केली पाहिजे.
9. सबक्लोन्स
बहुतेक वेळा, PCR हे केवळ प्राथमिक क्लोनिंग असते, आणि नंतर आम्हाला लक्ष्य तुकड्याला विविध व्हेक्टरमध्ये सबक्लोन करणे आवश्यक आहे, म्हणून आम्हाला PCR चरणात पुढील ऑपरेशनसाठी अतिरिक्त बेस डिझाइन करणे आवश्यक आहे.
सबक्लोनिंगसाठी डिझाइन केलेले काही क्रम खाली सारांशित केले आहेत.
प्रतिबंध endonuclease प्रतिबंध साइट जोडली गेली
एंझाइम प्रतिबंध साइट्स जोडणे ही PCR उत्पादनांच्या सबक्लोनिंगसाठी सर्वात सामान्यपणे वापरली जाणारी पद्धत आहे.साधारणपणे, क्लीव्हेज साइट सहा पाया आहे, 5 'अंत व्यतिरिक्त, 2 ~ 3 संरक्षक तळ जोडणे आवश्यक आहे.तथापि, वेगवेगळ्या एन्झाईम्ससाठी आवश्यक असलेल्या संरक्षणात्मक तळांची संख्या भिन्न आहे.उदाहरणार्थ, SalⅠ ला संरक्षणात्मक बेसची आवश्यकता नाही, EcoRⅤ ला 1 संरक्षणात्मक बेस आवश्यक आहे, NotⅠ ला 2 संरक्षणात्मक तळ आवश्यक आहेत आणि Hind Ⅲ ला 3 संरक्षणात्मक तळ आवश्यक आहेत.
एलआयसी शेपूट जोडते
एलआयसीचे पूर्ण नाव लिगेशन-स्वतंत्र क्लोनिंग आहे, ही क्लोनिंग पद्धत नॅव्होजेनने विशेषतः पीईटी वेक्टरच्या भागासाठी शोधली आहे.एलआयसी पद्धतीने तयार केलेल्या पीईटी कॅरियरमध्ये पूरक नसलेले १२-१५ बेस सिंगल स्ट्रँड चिकट टोके असतात, जे टार्गेट इन्सर्ट फ्रॅगमेंटवर संबंधित चिकट टोकांना पूरक असतात.अॅम्प्लीफिकेशनच्या उद्देशाने, घातलेल्या तुकड्याच्या प्राइमर 5′ क्रमाने LIC वेक्टरला पूरक असावे.T4 DNA पॉलिमरेझची 3′→5′ एक्स्ट्रॅक्ट अ‍ॅक्टिव्हिटी थोड्या वेळाने घातलेल्या तुकड्यावर एकच स्ट्रँड चिकट टोक तयार करू शकते.उत्पादन केवळ तयार इन्सर्ट फ्रॅगमेंट आणि वेक्टरच्या म्युच्युअल एनीलिंगमधून तयार केले जाऊ शकते, ही पद्धत अतिशय जलद आणि कार्यक्षम आहे आणि ती क्लोनिंगद्वारे निर्देशित केली जाते.
निर्देशित टीए क्लोन जोडा शेपूट
TA क्लोनिंग वेक्टरमध्ये तुकड्याला लक्ष्य करू शकले नाही, म्हणून नंतर Invitrogen ने एक वेक्टर आणला जो क्लोनिंगला लक्ष्य करू शकतो, ज्यामध्ये एका टोकाला चार प्रमुख बेस GTGGS होते.म्हणून, पीसीआर प्राइमर्सच्या डिझाइनमध्ये, त्यानुसार पूरक अनुक्रम जोडले जावे, जेणेकरून तुकडे "देणारं" होऊ शकतील.
जर तुमच्याकडे वेळ कमी असेल, तर तुम्ही थेट संश्लेषणाचा प्रयत्न करू शकता, व्हेक्टरसह जनुक एकत्र करून, ज्याला आम्ही म्युझिक्युलरमध्ये ET जनुक संश्लेषण म्हणतो.
D. इन-फ्यूजन क्लोनिंग पद्धत
लिगेस आवश्यक नाही, दीर्घ प्रतिक्रिया आवश्यक नाही.प्राइमरच्या डिझाइनमध्ये जोपर्यंत रेखीय वेक्टरच्या दोन्ही टोकांवर एक क्रम सुरू केला जातो, तोपर्यंत PCR उत्पादन आणि रेखीय वेक्टर BSA असलेल्या इन-फ्यूजन एंझाइम सोल्युशनमध्ये जोडले जातात आणि खोलीच्या तापमानाला अर्ध्या तासासाठी ठेवले जातात, परिवर्तन केले जाऊ शकते.ही पद्धत मोठ्या व्हॉल्यूम रूपांतरणासाठी विशेषतः योग्य आहे.
10. प्राइमर मर्ज करा
काहीवेळा, प्राइमर डिझाइनबद्दल केवळ मर्यादित अनुक्रम माहिती ज्ञात आहे.उदाहरणार्थ, जर फक्त एमिनो ऍसिडचा क्रम ज्ञात असेल तर, विलीन होणारे प्राइमर डिझाइन केले जाऊ शकते.विलीनीकरण प्राइमर हे विविध अनुक्रमांचे मिश्रण आहे जे एका अमीनो ऍसिडला एन्कोड करणार्‍या सर्व भिन्न मूलभूत शक्यतांचे प्रतिनिधित्व करते.विशिष्टता वाढवण्यासाठी, तुम्ही वेगवेगळ्या जीवांच्या मूलभूत वापराच्या प्राधान्यांनुसार जोडणी कमी करण्यासाठी कोडॉन वापर सारणीचा संदर्भ घेऊ शकता.प्राइमरचे एनीलिंग तापमान कमी करण्यासाठी हायपोक्सॅन्थिनला सर्व बेससह जोडले जाऊ शकते.प्राइमरच्या 3′ टोकाला जोडलेले बेस वापरू नका कारण 3′ शेवटी शेवटच्या 3 बेसचे एनीलिंग चुकीच्या ठिकाणी PCR सुरू करण्यासाठी पुरेसे आहे.उच्च प्राइमर सांद्रता (1μM ते 3μM) वापरली जाते कारण अनेक संलग्नक मिश्रणातील प्राइमर्स लक्ष्य टेम्पलेटसाठी विशिष्ट नसतात.
पीसीआर कच्चा मालनियंत्रण
1. प्राइमर प्रमाण
प्रत्येक प्राइमरची एकाग्रता 0.1 ~ 1umol किंवा 10 ~ 100pmol आहे.प्राइमरच्या सर्वात कमी प्रमाणात आवश्यक परिणाम देणे चांगले आहे.प्राइमरच्या उच्च एकाग्रतेमुळे विसंगत आणि विशिष्ट नसलेल्या प्रवर्धनास कारणीभूत ठरेल आणि प्राइमर्समध्ये डायमर तयार होण्याची शक्यता वाढेल.
2. प्राइमर एकाग्रता
प्राइमर्सची एकाग्रता विशिष्टतेवर परिणाम करते.इष्टतम प्राइमर एकाग्रता सामान्यतः 0.1 आणि 0.5μM दरम्यान असते.उच्च प्राइमर एकाग्रतेमुळे विशिष्ट नसलेल्या उत्पादनांचे प्रवर्धन होते.
3. प्राइमरचे एनीलिंग तापमान
प्राइमरसाठी आणखी एक महत्त्वाचा पॅरामीटर म्हणजे वितळण्याचे तापमान (टीएम).हे तापमान असते जेव्हा 50% प्राइमर्स आणि पूरक अनुक्रम दुहेरी-असरलेले DNA रेणू म्हणून दर्शविले जातात.पीसीआर अॅनिलिंग तापमान सेट करण्यासाठी टीएम आवश्यक आहे.तद्वतच, टार्गेट सीक्वेन्ससह प्राइमर्सचे प्रभावी अॅनिलिंग सुनिश्चित करण्यासाठी अॅनिलिंग तापमान पुरेसे कमी असते, परंतु विशिष्ट बंधन कमी करण्यासाठी पुरेसे उच्च असते.55℃ ते 70℃ पर्यंत वाजवी अॅनिलिंग तापमान.अॅनिलिंग तापमान सामान्यतः प्राइमरच्या Tm पेक्षा 5℃ कमी सेट केले जाते.
Tm सेट करण्यासाठी अनेक सूत्रे आहेत, जी वापरलेल्या सूत्रावर आणि प्राइमर्सच्या क्रमानुसार मोठ्या प्रमाणात बदलतात.कारण बहुतेक सूत्रे अंदाजे Tm मूल्य प्रदान करतात, सर्व अॅनिलिंग तापमान केवळ एक प्रारंभिक बिंदू आहे.अॅनिलिंग तापमान हळूहळू वाढवणाऱ्या अनेक प्रतिक्रियांचे विश्लेषण करून विशिष्टता सुधारली जाऊ शकते.अंदाजे Tm-5℃ खाली सुरू करा आणि हळूहळू 2℃ च्या वाढीमध्ये अॅनिलिंग तापमान वाढवा.उच्च अॅनिलिंग तापमानामुळे प्राइमर डायमर आणि गैर-विशिष्ट उत्पादनांची निर्मिती कमी होईल.सर्वोत्कृष्ट परिणामांसाठी, दोन प्राइमर्समध्ये अंदाजे Tm मूल्ये असावीत.प्राइमर जोड्यांचा Tm फरक 5℃ पेक्षा जास्त असल्यास, प्राइमर सायकलमध्ये कमी अॅनिलिंग तापमान वापरून महत्त्वपूर्ण चुकीची सुरुवात दाखवतील.दोन प्राइमर Tm भिन्न असल्यास, सर्वात कमी Tm पेक्षा 5℃ कमी अॅनिलिंग तापमान सेट करा.वैकल्पिकरित्या, विशिष्टता वाढवण्यासाठी, पाच चक्रे प्रथम उच्च टीएमसाठी डिझाइन केलेल्या अॅनिलिंग तापमानावर केली जाऊ शकतात, त्यानंतर उर्वरित चक्र कमी टीएमसाठी डिझाइन केलेल्या अॅनिलिंग तापमानात केली जाऊ शकतात.हे गंतव्य टेम्प्लेटची आंशिक प्रत घट्ट परिस्थितीत मिळवण्याची परवानगी देते.
4. प्राइमर शुद्धता आणि स्थिरता
सानुकूल प्राइमर्सची मानक शुद्धता बहुतेक पीसीआर अनुप्रयोगांसाठी पुरेशी आहे.डिसल्टिंगद्वारे बेंझॉयल आणि आयसोब्युटाइल गट काढून टाकणे कमीतकमी आहे आणि त्यामुळे पीसीआरमध्ये व्यत्यय आणत नाही.काही ऍप्लिकेशन्सना संश्लेषण प्रक्रियेतील कोणतेही गैर-पूर्ण-लांबीचे अनुक्रम काढण्यासाठी शुद्धीकरण आवश्यक आहे.हे कापलेले अनुक्रम घडतात कारण डीएनए संश्लेषण रसायनशास्त्राची कार्यक्षमता 100% नाही.ही एक वर्तुळाकार प्रक्रिया आहे जी 3′ ते 5′ पर्यंत DNA बनवण्यासाठी प्रत्येक बेस जोडल्यामुळे वारंवार रासायनिक अभिक्रिया वापरते.आपण कोणत्याही चक्रात अयशस्वी होऊ शकता.लांब प्राइमर्स, विशेषत: 50 पेक्षा जास्त बेसमध्ये, कापलेल्या अनुक्रमांचे मोठे प्रमाण असते आणि त्यांना शुद्धीकरणाची आवश्यकता असू शकते.
प्राइमर्सचे उत्पन्न सिंथेटिक रसायनशास्त्र आणि शुद्धीकरण पद्धतीच्या कार्यक्षमतेमुळे प्रभावित होते.बायोफार्मास्युटिकल कंपन्या, जसे की सायटोलॉजी आणि शेंगॉन्ग, ऑलिगोन्यूक्लिओसाइडचे एकूण उत्पादन सुनिश्चित करण्यासाठी सर्व किमान OD युनिट वापरतात.कस्टम प्राइमर्स कोरड्या पावडरच्या स्वरूपात पाठवले जातात.TE मध्ये प्राइमर्स पुन्हा विरघळणे चांगले आहे जेणेकरून अंतिम एकाग्रता 100μM असेल.डीआयोनाइज्ड पाण्यापेक्षा TE चांगले आहे कारण पाण्याचा pH अनेकदा अम्लीय असतो आणि त्यामुळे ऑलिगोन्यूक्लियोसाइड्सचे हायड्रोलिसिस होते.
प्राइमर्सची स्थिरता स्टोरेज परिस्थितीवर अवलंबून असते.कोरडी पावडर आणि विरघळलेले प्राइमर्स -20℃ वर साठवले पाहिजेत.TE मध्ये 10μM पेक्षा जास्त सांद्रतामध्ये विरघळलेले प्राइमर्स -20℃ वर 6 महिन्यांसाठी स्थिरपणे साठवले जाऊ शकतात, परंतु केवळ खोलीच्या तपमानावर (15℃ ते 30℃) 1 आठवड्यापेक्षा कमी साठवले जाऊ शकतात.ड्राय पावडर प्राइमर्स किमान 1 वर्षासाठी -20 सेल्सिअस तापमानात आणि 2 महिन्यांपर्यंत खोलीच्या तापमानात (15 से 30 सेल्सिअस) साठवले जाऊ शकतात.
5. एंजाइम आणि त्यांची एकाग्रता
सध्या, वापरलेले Taq DNA पॉलिमरेझ हे मुळात कोलिफॉर्म बॅक्टेरियाद्वारे संश्लेषित जनुक अभियांत्रिकी एन्झाइम आहे.विशिष्ट पीसीआर प्रतिक्रिया उत्प्रेरित करण्यासाठी आवश्यक एंझाइमची मात्रा सुमारे 2.5U आहे (100ul च्या एकूण प्रतिक्रिया खंडाचा संदर्भ देते).जर एकाग्रता खूप जास्त असेल तर ते विशिष्ट नसलेले प्रवर्धन होऊ शकते;एकाग्रता खूप कमी असल्यास, कृत्रिम उत्पादनाची मात्रा कमी केली जाईल.
6. dNTP ची गुणवत्ता आणि एकाग्रता
dNTP ची गुणवत्ता एकाग्रता आणि PCR प्रवर्धनाच्या कार्यक्षमतेशी जवळून संबंधित आहे.dNTP पावडर दाणेदार आहे, आणि जर ते अयोग्यरित्या साठवले गेले तर त्याची परिवर्तनशीलता त्याची जैविक क्रिया गमावते.dNTP द्रावण अम्लीय आहे, आणि 1M NaOH किंवा 1M Tris.HCL बफर सोल्यूशनसह उच्च एकाग्रतेमध्ये त्याचा PH 7.0 ~ 7.5, अल्प प्रमाणात उप-पॅकेजिंग, -20℃ वर गोठवलेले स्टोरेज समायोजित करण्यासाठी वापरले पाहिजे.मल्टिपल फ्रीझ-वितळणे dNTP खराब करेल.PCR प्रतिक्रिया मध्ये, dNTP 50 ~ 200umol/L असावा.विशेषतः, चार DNTPS च्या एकाग्रतेकडे लक्ष दिले पाहिजे समान (समान तीळ तयारी).जर त्यांपैकी कोणत्याही एकाची एकाग्रता इतरांपेक्षा वेगळी असेल (उच्च किंवा कमी), तर विसंगती निर्माण होईल.खूप कमी एकाग्रता पीसीआर उत्पादनांचे उत्पन्न कमी करेल.dNTP Mg2+ सह एकत्रित करू शकते आणि विनामूल्य Mg2+ ची एकाग्रता कमी करू शकते.
7. टेम्प्लेट (लक्ष्य जनुक) न्यूक्लिक अॅसिड
टेम्प्लेट न्यूक्लिक अॅसिडचे प्रमाण आणि शुद्धीकरण पदवी हे पीसीआरच्या यश किंवा अयशस्वी होण्याच्या मुख्य दुव्यांपैकी एक आहे.पारंपारिक डीएनए शुद्धीकरण पद्धती नमुने पचवण्यासाठी आणि विल्हेवाट लावण्यासाठी SDS आणि प्रोटीज K चा वापर करतात.एसडीएसची मुख्य कार्ये आहेत: सेल झिल्लीवरील लिपिड्स आणि प्रथिने विरघळवणे, अशा प्रकारे झिल्लीतील प्रथिने विरघळवून सेल झिल्ली नष्ट करणे आणि सेलमधील आण्विक प्रथिने वेगळे करणे, एसडीएस देखील प्रथिनांसह एकत्रित होऊ शकते आणि अवक्षेपण करू शकते;Protease K प्रथिने हायड्रोलायझ करू शकते आणि पचवू शकते, विशेषत: DNA सह बांधलेले हिस्टोन्स, आणि नंतर प्रथिने आणि इतर पेशी घटक काढण्यासाठी सेंद्रिय सॉल्व्हेंट फिनॉल आणि क्लोरोफॉर्म वापरतात आणि न्यूक्लिक अॅसिड तयार करण्यासाठी इथेनॉल किंवा आयसोप्रोपाइल अल्कोहोल वापरतात.काढलेले न्यूक्लिक अॅसिड पीसीआर प्रतिक्रियांसाठी टेम्पलेट म्हणून वापरले जाऊ शकते.सामान्य क्लिनिकल डिटेक्शन नमुन्यांसाठी, एक जलद आणि सोपी पद्धत पेशी विरघळण्यासाठी, रोगजनक लाइसेट करण्यासाठी, गुणसूत्रांपासून मुक्त लक्ष्य जनुकांपर्यंत प्रथिने पचवण्यासाठी आणि काढून टाकण्यासाठी आणि थेट पीसीआर प्रवर्धनासाठी वापरली जाऊ शकते.RNA टेम्प्लेट एक्सट्रॅक्शनमध्ये सामान्यतः guanidine isothiocyanate किंवा Protease K पद्धतीचा वापर केला जातो ज्यामुळे RNase ला RNA खराब होण्यापासून रोखता येते.
8.Mg2+ एकाग्रता
Mg2+ चा PCR अॅम्प्लीफिकेशनच्या विशिष्टतेवर आणि उत्पन्नावर महत्त्वपूर्ण प्रभाव पडतो.सामान्य पीसीआर प्रतिक्रियामध्ये, जेव्हा विविध dNTP ची एकाग्रता 200umol/L असते, तेव्हा Mg2+ ची योग्य एकाग्रता 1.5 ~ 2.0mmol/L असते.Mg2+ एकाग्रता खूप जास्त आहे, प्रतिक्रिया विशिष्टता कमी होते, गैर-विशिष्ट प्रवर्धन होते, खूप कमी एकाग्रतेमुळे Taq DNA पॉलिमरेझची क्रिया कमी होते, परिणामी प्रतिक्रिया उत्पादने कमी होतात.
मॅग्नेशियम आयन पीसीआरच्या अनेक पैलूंवर परिणाम करतात, जसे की डीएनए पॉलिमरेज क्रियाकलाप, ज्यामुळे उत्पन्नावर परिणाम होतो;दुसरे उदाहरण म्हणजे प्राइमर एनीलिंग, जे विशिष्टतेवर परिणाम करते.dNTP आणि टेम्प्लेट मॅग्नेशियम आयनशी बांधले जातात, एंझाइम क्रियाकलापांसाठी आवश्यक असलेले मुक्त मॅग्नेशियम आयनचे प्रमाण कमी करते.इष्टतम मॅग्नेशियम आयन एकाग्रता वेगवेगळ्या प्राइमर जोड्या आणि टेम्पलेट्ससाठी बदलते, परंतु 200μM dNTP सह एक सामान्य PCR सुरू होणारी एकाग्रता 1.5mM आहे (टीप: वास्तविक-वेळ परिमाणात्मक PCR साठी, फ्लोरोसेंट प्रोबसह 3 ते 5mM मॅग्नेशियम आयन द्रावण वापरा).मुक्त मॅग्नेशियम आयनची उच्च सांद्रता उत्पन्न वाढवते, परंतु अविशिष्ट प्रवर्धन देखील वाढवते आणि निष्ठा कमी करते.इष्टतम एकाग्रता निश्चित करण्यासाठी, मॅग्नेशियम आयन टायट्रेशन 1mM ते 3mM 0.5mM च्या वाढीमध्ये केले गेले.मॅग्नेशियम आयन ऑप्टिमायझेशनवरील अवलंबित्व कमी करण्यासाठी, प्लॅटिनम टाक डीएनए पॉलिमरेझचा वापर केला जाऊ शकतो.प्लॅटिनम टाक डीएनए पॉलिमरेझ टाक डीएनए पॉलिमरेझपेक्षा मॅग्नेशियम आयन एकाग्रतेच्या विस्तृत श्रेणीवर कार्य करण्यास सक्षम आहे आणि म्हणून कमी ऑप्टिमायझेशन आवश्यक आहे.
9. पीसीआर-प्रोमोटिंग अॅडिटीव्ह
अॅनिलिंग तापमान, प्राइमर डिझाइन आणि मॅग्नेशियम आयन एकाग्रतेचे ऑप्टिमायझेशन बहुतेक टेम्पलेट्सच्या उच्च विशिष्ट प्रवर्धनासाठी पुरेसे आहे;तथापि, उच्च GC सामग्रीसह काही टेम्पलेट्सना अतिरिक्त उपाय आवश्यक आहेत.डीएनएच्या वितळण्याच्या तपमानावर परिणाम करणारे पदार्थ उत्पादनाची विशिष्टता आणि उत्पन्न सुधारण्याचा दुसरा मार्ग देतात.सर्वोत्तम परिणामांसाठी टेम्पलेटचे पूर्ण विकृतीकरण आवश्यक आहे.
याव्यतिरिक्त, दुय्यम रचना प्राइमर बंधनकारक आणि एंजाइम विस्तार प्रतिबंधित करते.
फॉर्मॅमाइड, DMSO, ग्लिसरीन, बेटेन आणि पीसीआरएक्स एन्हान्सर सोल्यूशनसह पीसीआर अॅडिटीव्ह, प्रवर्धन वाढवतात.त्यांची संभाव्य यंत्रणा म्हणजे वितळण्याचे तापमान कमी करणे, अशा प्रकारे प्राइमर्सच्या ऍनिलिंगला मदत करणे आणि दुय्यम संरचना क्षेत्राद्वारे डीएनए पॉलिमरेझ विस्तारास मदत करणे.PCRx Solution चे इतर फायदे आहेत.प्लॅटिनम टाक डीएनए पॉलिमरेझ आणि प्लॅटिनम पीएफएक्स डीएनए पॉलिमरेझसह वापरताना किमान मॅग्नेशियम आयन ऑप्टिमायझेशन आवश्यक आहे.अशाप्रकारे, मॅग्नेशियम आयन ऑप्टिमायझेशन या तिसर्या पद्धतीचे अवलंबित्व कमी करताना विशिष्टता वाढविण्यासाठी प्लॅटिनम तंत्र जोडणीसह एकत्र केले जाते.सर्वोत्कृष्ट परिणामांसाठी, अॅडिटीव्हची एकाग्रता ऑप्टिमाइझ केली पाहिजे, विशेषत: DMSO, फॉर्मामाइड आणि ग्लिसरॉल, जे Taq DNA पॉलिमरेझला प्रतिबंधित करते.
10. हॉट स्टार्ट
चांगल्या प्राइमर डिझाइन व्यतिरिक्त पीसीआर विशिष्टता सुधारण्यासाठी हॉट स्टार्ट पीसीआर ही सर्वात महत्त्वाची पद्धत आहे.Taq DNA पॉलिमरेझचे इष्टतम विस्तार तापमान 72℃ असले तरी, खोलीच्या तपमानावर पॉलिमरेझ सक्रिय राहते.अशाप्रकारे, पीसीआर प्रतिक्रिया तयार करताना आणि थर्मल सायकलच्या सुरूवातीस होल्डिंग तापमान अॅनिलिंग तापमानापेक्षा कमी असते तेव्हा गैर-विशिष्ट उत्पादने तयार केली जातात.एकदा तयार झाल्यानंतर, ही विशिष्ट नसलेली उत्पादने प्रभावीपणे वाढविली जातात.हॉट-स्टार्ट पीसीआर विशेषतः प्रभावी आहे जेव्हा प्राइमर डिझाइनसाठी वापरल्या जाणार्‍या साइट्स अनुवांशिक घटकांच्या स्थानाद्वारे मर्यादित असतात, जसे की साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन, अभिव्यक्ती क्लोनिंग किंवा DNA अभियांत्रिकीसाठी वापरल्या जाणार्‍या अनुवांशिक घटकांचे बांधकाम आणि हाताळणी.
Taq DNA पॉलिमरेझची क्रिया मर्यादित करण्यासाठी एक सामान्य पद्धत म्हणजे बर्फावर पीसीआर प्रतिक्रिया द्रावण तयार करणे आणि ते प्रीहेटेड पीसीआर उपकरणामध्ये ठेवणे.ही पद्धत सोपी आणि स्वस्त आहे, परंतु ती एंजाइमची क्रिया पूर्ण करत नाही आणि त्यामुळे विशिष्ट नसलेल्या उत्पादनांचे प्रवर्धन पूर्णपणे काढून टाकत नाही.
थर्मल प्राइमिंग एक आवश्यक घटक रोखून डीएनए संश्लेषणास विलंब करते जोपर्यंत पीसीआर उपकरणे विकृत तापमानापर्यंत पोहोचत नाही.टाक डीएनए पॉलिमरेझच्या विलंबित जोडणीसह बहुतेक मॅन्युअल थर्मल इनिशिएशन पद्धती, विशेषतः उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगांसाठी, अवजड आहेत.इतर थर्मल प्राइमिंग पद्धती मॅग्नेशियम आयन किंवा एन्झाईम्ससह आवश्यक घटक बंदिस्त करण्यासाठी किंवा टेम्प्लेट्स आणि बफर सारख्या प्रतिक्रियाशील घटकांना शारीरिकरित्या वेगळे करण्यासाठी मेणाच्या ढालचा वापर करतात.थर्मल सायकल दरम्यान, मेण वितळल्यावर विविध घटक सोडले जातात आणि एकत्र मिसळले जातात.मॅन्युअल हॉट स्टार्ट पद्धतीप्रमाणे, वॅक्स शील्ड पद्धत त्रासदायक आणि दूषित होण्यास प्रवण आहे आणि उच्च थ्रूपुट अनुप्रयोगांसाठी योग्य नाही.
प्लॅटिनम डीएनए पॉलिमरेझ स्वयंचलित हॉट स्टार्ट पीसीआरसाठी सोयीस्कर आणि कार्यक्षम आहे.प्लॅटिनम टाक डीएनए पॉलिमरेझमध्ये टाक डीएनए पॉलिमरेझच्या विरूद्ध मोनोक्लोनल अँटीबॉडीसह एकत्रित रीकॉम्बीनंट टाक डीएनए पॉलिमरेझ असते.प्रदीर्घ तापमान धारण करताना एन्झाईमची क्रिया रोखण्यासाठी प्रतिपिंडे पीसीआरद्वारे तयार केली जातात.Taq DNA पॉलिमरेझ विकृतीकरण चरणाच्या 94℃ इन्सुलेशन दरम्यान प्रतिक्रियामध्ये सोडण्यात आले, पूर्ण पॉलिमरेझ क्रियाकलाप पुनर्संचयित केले.थर्मल इनिशिएशनसाठी रासायनिक सुधारित Taq DNA पॉलिमरेझच्या उलट, प्लॅटिनम एन्झाइमला पॉलिमरेझ सक्रिय करण्यासाठी 94℃ (10 ते 15 मिनिटे) वर दीर्घकाळ इन्सुलेशनची आवश्यकता नसते.PlatinumTaq DNA polymerase सह, Taq DNA पॉलिमरेझची 90% क्रिया 2 मिनिटांनंतर 94℃ वर पुनर्संचयित केली गेली.
11. नेस्ट-पीसीआर
नेस्टेड प्राइमर्सचा वापर करून प्रवर्धनाच्या सलग फेऱ्या विशिष्टता आणि संवेदनशीलता सुधारू शकतात.पहिली फेरी 15 ते 20 चक्रांचे मानक प्रवर्धन आहे.प्रारंभिक प्रवर्धन उत्पादनाचा एक लहान अंश 100 ते 1000 वेळा पातळ केला गेला आणि 15 ते 20 चक्रांसाठी प्रवर्धनाच्या दुसऱ्या फेरीत जोडला गेला.वैकल्पिकरित्या, प्रारंभिक प्रवर्धित उत्पादनाचा आकार जेल शुद्धीकरणाद्वारे केला जाऊ शकतो.एम्प्लिफिकेशनच्या दुसऱ्या फेरीत नेस्टेड प्राइमरचा वापर केला जातो, जो पहिल्या प्राइमरच्या आत लक्ष्य क्रमाशी जोडू शकतो.नेस्टेड पीसीआरचा वापर एकाधिक लक्ष्य साइट्सच्या वाढीची शक्यता कमी करतो कारण प्राइमरच्या दोन्ही सेटसाठी काही लक्ष्य अनुक्रम पूरक आहेत.समान प्राइमरसह समान एकूण चक्र (30 ते 40) ने विशिष्ट नसलेल्या स्थळांना विस्तारित केले.नेस्टेड पीसीआर मर्यादित लक्ष्य अनुक्रमांची (उदा. दुर्मिळ mrnas) संवेदनशीलता वाढवते आणि अवघड PCRS (उदा. 5′ RACE) ची विशिष्टता सुधारते.
12. उतरत्या PCR
डिसेंडिंग पीसीआर पीसीआरच्या पहिल्या काही चक्रांसाठी घट्ट अॅनिलिंग परिस्थिती वापरून विशिष्टता सुधारते.सायकल अंदाजे Tm पेक्षा अंदाजे 5℃ जास्त असलेल्या अॅनिलिंग तापमानापासून सुरू होते, त्यानंतर प्रत्येक चक्र 1℃ ते 2℃ ने कमी केले जाते जोपर्यंत अॅनिलिंग तापमान Tm 5℃ पेक्षा कमी होत नाही.केवळ सर्वोच्च समरूपता असलेले गंतव्य टेम्पलेट विस्तारित केले जाईल.ही उत्पादने नंतरच्या चक्रांमध्ये विस्तारत राहतात, वाढीव विशिष्ट नसलेल्या उत्पादनांची गर्दी करतात.AFLP DNA फिंगरप्रिंटिंग सारख्या प्राइमर आणि टार्गेट टेम्प्लेटमधील समरूपतेची डिग्री माहित नसलेल्या पद्धतींसाठी डिसेंडिंग पीसीआर उपयुक्त आहे.
संबंधित पीसीआर किट
2× पीसीआर हिरोTMमिक्स सिस्टममध्ये सामान्य पीसीआर मिक्स सिस्टमपेक्षा पीसीआर अवरोधकांना जास्त सहनशीलता असते आणि ती विविध जटिल टेम्पलेट्सच्या पीसीआर प्रवर्धनास सहजपणे तोंड देऊ शकते.अद्वितीय प्रतिक्रिया प्रणाली आणि उच्च-कार्यक्षमता Taq Hero PCR प्रतिक्रियेमध्ये उच्च प्रवर्धन कार्यक्षमता, विशिष्टता आणि संवेदनशीलता बनवते.
उच्च प्रवर्धन कार्यक्षमता
यात 5'→3' डीएनए पॉलिमरेझ क्रियाकलाप आणि 5'→3' एक्सोन्यूक्लीज क्रियाकलाप आहे, 3'→5' एक्सोन्यूक्लीज क्रियाकलापाशिवाय.
रिअल टाइम PCR Easyᵀᴹ-SYBR ग्रीन I किट
विशिष्ट-अनुकूलित बफर आणि हॉट-स्टार्ट Taq एन्झाइम गैर-विशिष्ट प्रवर्धन आणि प्राइमर डायमर निर्मिती रोखू शकतात
उच्च संवेदनशीलता - टेम्पलेटच्या कमी प्रती शोधू शकतात
किट एक अद्वितीय फोरजीन रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन अभिकर्मक आणि फोरजीन हॉटस्टार टाक डीएनए पॉलिमरेझ वापरते आणि अभिक्रियाची प्रवर्धन कार्यक्षमता आणि विशिष्टता प्रभावीपणे सुधारण्यासाठी अद्वितीय प्रतिक्रिया प्रणालीसह एकत्रित करते.
पोस्ट वेळ: मे-०९-२०२३
