प्रारंभिक सामग्री: आरएनए
क्वांटिटेटिव्ह रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन PCR (RT-qPCR) ही प्रायोगिक पद्धत आहे जी पीसीआर प्रयोगांमध्ये RNA वापरून प्रारंभिक सामग्री म्हणून वापरली जाते.या पद्धतीमध्ये, एकूण RNA किंवा मेसेंजर RNA (mRNA) प्रथम रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेजद्वारे पूरक DNA (cDNA) मध्ये लिप्यंतरण केले जाते.त्यानंतर, टेम्पलेट म्हणून cDNA वापरून qPCR प्रतिक्रिया केली गेली.RT-qPCR चा वापर विविध आण्विक जीवशास्त्र अनुप्रयोगांमध्ये केला गेला आहे, ज्यामध्ये जनुक अभिव्यक्ती विश्लेषण, RNA हस्तक्षेप प्रमाणीकरण, मायक्रोएरे प्रमाणीकरण, रोगजनक शोध, अनुवांशिक चाचणी आणि रोग संशोधन यांचा समावेश आहे.
RT-qPCR साठी एक-चरण आणि द्वि-चरण पद्धती
RT-qPCR एक-चरण किंवा दोन-चरण पद्धतीद्वारे पूर्ण केले जाऊ शकते.वन-स्टेप RT-qPCR रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन आणि PCR अॅम्प्लीफिकेशन एकत्र करते, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस आणि डीएनए पॉलिमरेझला समान बफर परिस्थितीत समान ट्यूबमध्ये प्रतिक्रिया पूर्ण करण्यास अनुमती देते.वन-स्टेप RT-qPCR ला फक्त अनुक्रम-विशिष्ट प्राइमर्स वापरणे आवश्यक आहे.टू-स्टेप RT-qPCR मध्ये, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन आणि PCR अॅम्प्लीफिकेशन दोन ट्यूबमध्ये केले जाते, भिन्न ऑप्टिमाइझ केलेले बफर, प्रतिक्रिया परिस्थिती आणि प्राइमर डिझाइन धोरणे वापरून.
| फायदा | गैरसोय | |
| एक पाऊल | या पद्धतीमध्ये कमी प्रायोगिक त्रुटी आहे कारण दोन्ही प्रतिक्रिया एकाच नळीमध्ये केल्या जातात
पाइपिंगच्या कमी पायऱ्या दूषित होण्याचा धोका कमी करतात
उच्च-थ्रूपुट अॅम्प्लिफिकेशन/स्क्रीनिंगसाठी योग्य, जलद आणि पुनरुत्पादक | द्वि-चरण प्रतिक्रिया स्वतंत्रपणे ऑप्टिमाइझ केल्या जाऊ शकत नाहीत
द्वि-चरण प्रतिक्रिया एकत्र करून प्रतिक्रिया परिस्थितीशी तडजोड केली जात असल्याने, संवेदनशीलता द्वि-चरण पद्धतीइतकी चांगली नसते.
एका नमुन्याद्वारे शोधलेल्या लक्ष्यांची संख्या कमी आहे |
| दोन पावले | स्थिर cDNA लायब्ररी तयार करण्याची क्षमता जी दीर्घ कालावधीसाठी संग्रहित केली जाऊ शकते आणि एकाधिक प्रतिक्रियांमध्ये वापरली जाऊ शकते
एकाच cDNA लायब्ररीतून लक्ष्यित जीन्स आणि संदर्भ जनुकांना एकाधिक cDNA लायब्ररीची आवश्यकता न ठेवता वाढवता येते.
रिअॅक्शन बफर आणि रिअॅक्शन कंडिशन जे एकल रिअॅक्शन रनचे ऑप्टिमायझेशन सक्षम करतात
ट्रिगर परिस्थितीची लवचिक निवड | एकाधिक नळ्या वापरणे, आणि अधिक पायपीट करणे DNA दूषित होण्याचा धोका वाढवते, आणि वेळ घेणारे.
एक-चरण पद्धतीपेक्षा अधिक ऑप्टिमायझेशन आवश्यक आहे |
संबंधित उत्पादने:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (एक टप्पा)-SYBR ग्रीन I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (एक पाऊल)-तकमान
फर्स्ट-स्ट्रँड सीडीएनए संश्लेषणासाठी RT Easyᴹ I मास्टर प्रीमिक्स
रिअल टाइम PCR Easyᵀᴹ-SYBR ग्रीन I किट
एकूण RNA आणि mRNA ची निवड
RT-qPCR प्रयोगाची रचना करताना, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनसाठी टेम्प्लेट म्हणून एकूण RNA किंवा शुद्ध mRNA वापरायचे की नाही हे ठरवणे महत्त्वाचे आहे.जरी mRNA किंचित जास्त संवेदनशीलता प्रदान करण्यास सक्षम असले तरी, एकूण RNA अजूनही वारंवार वापरले जाते.याचे कारण असे आहे की एकूण आरएनएचा mRNA पेक्षा प्रारंभिक सामग्री म्हणून अधिक महत्त्वाचा फायदा आहे.प्रथम, प्रक्रियेसाठी कमी शुद्धीकरण चरणांची आवश्यकता असते, जे टेम्प्लेटची चांगली परिमाणात्मक पुनर्प्राप्ती आणि सेल नंबर सुरू करण्यासाठी परिणामांचे चांगले सामान्यीकरण सुनिश्चित करते.दुसरे, ते mRNA संवर्धनाची पायरी टाळते, जे वेगवेगळ्या mRNA च्या वेगवेगळ्या पुनर्प्राप्तीमुळे विस्कळीत परिणामांची शक्यता टाळू शकते.एकंदरीत, बहुतेक ऍप्लिकेशन्समध्ये लक्ष्य जनुकाचे सापेक्ष परिमाण शोधण्याच्या परिपूर्ण संवेदनशीलतेपेक्षा अधिक महत्त्वाचे असल्याने, बहुतेक प्रकरणांमध्ये एकूण आरएनए अधिक योग्य आहे.
रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्राइमर
द्वि-चरण पद्धतीमध्ये, सीडीएनए प्रतिक्रिया प्राइम करण्यासाठी तीन वेगवेगळ्या पद्धती वापरल्या जाऊ शकतात: ओलिगो(डीटी) प्राइमर्स, यादृच्छिक प्राइमर्स किंवा अनुक्रम-विशिष्ट प्राइमर्स.सामान्यतः, oligo(dT) प्राइमर्स आणि यादृच्छिक प्राइमर्स एकत्रितपणे वापरले जातात.हे प्राइमर्स टेम्पलेट mRNA स्ट्रँडला जोडतात आणि संश्लेषणासाठी प्रारंभिक बिंदूसह रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस प्रदान करतात.
| प्राइमर निवड | रचना आणि कार्य | फायदा | गैरसोय |
| ऑलिगो(डीटी) प्राइमर (किंवा अँकर केलेला ऑलिगो(डीटी) प्राइमर) | mRNA च्या पॉली(A) शेपटीत थायमिनच्या अवशेषांवर विस्तारित ऍनिलिंग;अँकर ऑलिगो(dT) प्राइमरमध्ये 3′ शेवटी G, C किंवा A असतो (अँकर साइट) | पॉली(ए)-पुच्छ mRNA पासून पूर्ण-लांबीच्या cDNA चे संश्लेषण
कमी प्रारंभिक सामग्री उपलब्ध असताना लागू
अँकरिंग साइट हे सुनिश्चित करते की oligo(dT) प्राइमर mRNA च्या 5′ पॉली(A) शेपटीला जोडतो. | केवळ पॉली(ए) शेपटी असलेल्या जनुकांच्या वाढीसाठी योग्य
पॉली(A) मध्ये प्राइमिंग साइट*2 वरून कापलेले cDNA मिळवा
3′ शेवटी बांधण्यासाठी पक्षपाती*
*अँकर केलेले ऑलिगो(dT) प्राइमर्स वापरल्यास ही शक्यता कमी होते |
| यादृच्छिक प्राइमर
| लांबीचे 6 ते 9 बेस, जे RNA ट्रान्सक्रिप्शन दरम्यान एकाधिक साइटवर जोडू शकतात | सर्व RNAs (tRNA, rRNA, आणि mRNA) ला जोडणे
महत्त्वपूर्ण दुय्यम संरचनेसह किंवा कमी प्रारंभिक सामग्री उपलब्ध असताना प्रतिलिपींसाठी योग्य
उच्च सीडीएनए उत्पन्न | सीडीएनए सर्व आरएनए मधून उलट लिप्यंतरण केले जाते, जे सहसा इच्छित नसते आणि लक्ष्य mRNA चे सिग्नल सौम्य करू शकते.
कापलेले सीडीएनए मिळवा |
| अनुक्रम-विशिष्ट प्राइमर्स | विशिष्ट mRNA अनुक्रमांना लक्ष्य करणारे कस्टम प्राइमर्स | विशिष्ट cDNA लायब्ररी
संवेदनशीलता सुधारा
रिव्हर्स क्यूपीसीआर प्राइमर्स वापरणे | केवळ एकाच लक्ष्य जनुकाच्या संश्लेषणापुरते मर्यादित |
उलट ट्रान्सक्रिप्टेस
रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस हे एक एन्झाइम आहे जे डीएनएचे संश्लेषण करण्यासाठी आरएनए वापरते.काही रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसमध्ये RNase क्रिया असते आणि ते ट्रान्सक्रिप्शननंतर RNA-DNA संकरित स्ट्रँड्समध्ये RNA स्ट्रँड्स खराब करू शकतात.जर त्यात RNase एन्झाइमॅटिक क्रियाकलाप नसेल, तर उच्च qPCR कार्यक्षमतेसाठी RNaseH जोडले जाऊ शकते.सामान्यतः वापरल्या जाणार्‍या एन्झाईममध्ये मोलोनी मुरिन ल्युकेमिया व्हायरस रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस आणि एव्हियन मायलोब्लास्टोमा व्हायरस रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस यांचा समावेश होतो.RT-qPCR साठी, उच्च थर्मोस्टॅबिलिटीसह रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस निवडणे योग्य आहे, जेणेकरून उच्च तापमानात cDNA संश्लेषण केले जाऊ शकते, उच्च माध्यमिक संरचनेसह RNA चे यशस्वी लिप्यंतरण सुनिश्चित करून, संपूर्ण प्रतिक्रियेमध्ये त्यांची संपूर्ण क्रियाशीलता राखून, परिणामी उच्च cDNA उत्पन्न मिळते.
संबंधित उत्पादने:
Foreasy M-MLV रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस
रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसची RNase H क्रियाकलाप
RNaseH RNA-DNA डुप्लेक्सेसमधून RNA स्ट्रँड्स कमी करण्यास सक्षम आहे, ज्यामुळे डबल-स्ट्रँडेड DNA चे कार्यक्षम संश्लेषण होऊ शकते.तथापि, टेम्पलेट म्हणून लांब mRNA वापरताना, RNA अकाली कमी होऊ शकते, परिणामी cDNA कापला जातो.त्यामुळे, दीर्घ प्रतिलेखांचे संश्लेषण हवे असल्यास cDNA क्लोनिंग दरम्यान RNaseH क्रियाकलाप कमी करणे फायदेशीर ठरते.याउलट, RNase H अॅक्टिव्हिटीसह रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस qPCR ऍप्लिकेशन्ससाठी फायदेशीर ठरतात कारण ते PCR च्या पहिल्या चक्रादरम्यान RNA-DNA डुप्लेक्सचे वितळणे वाढवतात.
प्राइमर डिझाइन
RT-qPCR मधील qPCR स्टेपसाठी वापरलेले PCR प्राइमर्स आदर्शपणे एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शनच्या विस्तारासाठी डिझाइन केलेले असावेत, जेथे एम्प्लिफिकेशन प्राइमर संभाव्यतः वास्तविक एक्सॉन-इंट्रॉन सीमा व्यापू शकतो.इंट्रोन-युक्त जीनोमिक डीएनए अनुक्रम वाढवलेले नसल्यामुळे, हे डिझाइन जीनोमिक डीएनए दूषित होण्यापासून वाढीव खोट्या सकारात्मकतेचा धोका कमी करते.
एक्सॉन किंवा एक्सॉन-एक्सॉन सीमा विभक्त करण्यासाठी प्राइमर्स डिझाइन केले जाऊ शकत नसल्यास, जीनोमिक डीएनए दूषितता काढून टाकण्यासाठी RNA नमुन्यांना RNase-मुक्त DNase I किंवा dsDNase सह उपचार करणे आवश्यक असू शकते.
RT-qPCR नियंत्रण
डीएनए दूषितता (जसे की जीनोमिक डीएनए किंवा मागील प्रतिक्रियांमधून पीसीआर उत्पादने) शोधण्यासाठी सर्व RT-qPCR प्रयोगांमध्ये रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन नकारात्मक नियंत्रण (-RT नियंत्रण) समाविष्ट केले जावे.या नियंत्रणामध्ये रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस वगळता सर्व प्रतिक्रिया घटक असतात.या नियंत्रणासह रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन होत नसल्यामुळे, जर पीसीआर प्रवर्धन पाहिल्यास, डीएनए मधून दूषित होण्याची शक्यता असते.
पोस्ट वेळ: ऑगस्ट-02-2022
