1. मूलभूत ज्ञान (जर तुम्हाला प्रायोगिक भाग पाहायचा असेल तर, कृपया थेट दुसऱ्या भागात हस्तांतरित करा)

पारंपारिक PCR ची व्युत्पन्न प्रतिक्रिया म्हणून, रिअल टाइम PCR मुख्यत्वे PCR प्रवर्धक प्रतिक्रियेच्या प्रत्येक चक्रामध्ये प्रतिदीप्ति सिग्नलच्या बदलाद्वारे रीअल टाइममध्ये अॅम्प्लीफिकेशन उत्पादनाच्या बदलाचे निरीक्षण करते आणि ct मूल्य आणि मानक वक्र यांच्यातील संबंधांद्वारे प्रारंभिक टेम्पलेटचे परिमाणात्मक विश्लेषण करते.

RT-PCR चा विशिष्ट डेटा आहेबेसलाइन, फ्लोरोसेन्स थ्रेशोल्डआणिCt मूल्य.

RT-PCR साठी सामान्य लेबलिंग पद्धती:

2. प्रायोगिक पायऱ्या

2.1 प्रायोगिक गटाबद्दल- गटामध्ये अनेक विहिरी असणे आवश्यक आहे आणि जैविक पुनरावृत्ती असणे आवश्यक आहे.

2.2 प्राइमर डिझाइनची तत्त्वे

①SiRNA ही प्रजाती-विशिष्ट आहे आणि वेगवेगळ्या प्रजातींचे अनुक्रम भिन्न असतील.

②SiRNA फ्रीझ-वाळलेल्या पावडरमध्ये पॅक केले जाते, जे खोलीच्या तपमानावर 2-4 आठवडे स्थिरपणे साठवले जाऊ शकते.

2.3 उपकरणे किंवा अभिकर्मक जे आगाऊ तयार करणे आवश्यक आहे

2.4 विशिष्ट प्रायोगिक चरणांमध्ये ज्या मुद्द्यांकडे लक्ष देणे आवश्यक आहे त्याबाबत:

①siRNA संक्रमण प्रक्रिया

1. प्लेटिंगसाठी, आपण 24-वेल प्लेट, 12-वेल प्लेट किंवा 6-वेल प्लेट निवडू शकता (24-वेल प्लेटच्या प्रत्येक विहिरीमध्ये प्रस्तावित सरासरी RNA एकाग्रता सुमारे 100-300 ng/uL आहे), आणि पेशींची इष्टतम अभिसरण घनता 60% किंवा 80% पर्यंत आहे.

2. ट्रान्सफेक्शन टप्पे आणि विशिष्ट आवश्यकता सूचनांनुसार काटेकोरपणे आहेत.

3. संक्रमणानंतर, mRNA डिटेक्शन (RT-PCR) किंवा 48-96 तासांच्या आत प्रोटीन शोधण्यासाठी 24-72 तासांच्या आत नमुने गोळा केले जाऊ शकतात (WB)

② RNA काढण्याची प्रक्रिया

1. एक्सोजेनस एन्झाईम्सद्वारे दूषित होण्यास प्रतिबंध करा.त्यात प्रामुख्याने मुखवटे आणि हातमोजे घालणे काटेकोरपणे समाविष्ट आहे;निर्जंतुकीकृत विंदुक टिपा आणि EP ट्यूब वापरणे;प्रयोगात वापरलेले पाणी RNase-मुक्त असणे आवश्यक आहे.

2. द्रुत निष्कर्षण किटमध्ये सुचविल्याप्रमाणे दुप्पट करण्याची शिफारस केली जाते, जे खरोखर शुद्धता आणि उत्पन्न सुधारेल.

3. कचरा द्रव RNA स्तंभाला स्पर्श करू नये.

③ RNA परिमाण

RNA काढल्यानंतर, ते थेट नॅनोड्रॉपसह परिमाण केले जाऊ शकते, आणि किमान वाचन 10ng/ul इतके कमी असू शकते.

④ रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रक्रिया

1. RT-qPCR च्या उच्च संवेदनशीलतेमुळे, प्रत्येक नमुन्यासाठी किमान 3 समांतर विहिरी बनवल्या पाहिजेत जेणेकरून नंतरचे Ct खूप वेगळे होऊ नये किंवा SD संख्याशास्त्रीय विश्लेषणासाठी खूप मोठे होऊ नये.

2. मास्टर मिक्स वारंवार गोठवू नका आणि वितळवू नका.

3. प्रत्येक ट्यूब/होल नवीन टीपने बदलणे आवश्यक आहे!नमुने जोडण्यासाठी सतत समान पिपेट टीप वापरू नका!

4. नमुना जोडल्यानंतर 96-वेल प्लेटला जोडलेली फिल्म प्लेटने गुळगुळीत करणे आवश्यक आहे.मशीनवर ठेवण्यापूर्वी सेंट्रीफ्यूज करणे चांगले आहे, जेणेकरून ट्यूबच्या भिंतीवरील द्रव खाली वाहू शकेल आणि हवेचे फुगे काढून टाकू शकेल.

⑤सामान्य वक्र विश्लेषण

2.5 डेटा विश्लेषण बद्दल

qPCR चे डेटा विश्लेषण सापेक्ष परिमाण आणि परिपूर्ण परिमाणात विभागले जाऊ शकते.उदाहरणार्थ, नियंत्रण गटातील पेशींच्या तुलनेत उपचार गटातील पेशी,

X जनुकाचा mRNA किती वेळा बदलतो, हे सापेक्ष परिमाण आहे;विशिष्ट संख्येच्या पेशींमध्ये, X जनुकाचा mRNA

किती प्रती आहेत, हे परिपूर्ण परिमाण आहे.सहसा आपण प्रयोगशाळेत सर्वात जास्त वापरतो ती सापेक्ष परिमाणात्मक पद्धत.सहसा,2-ΔΔct पद्धतप्रयोगांमध्ये सर्वात जास्त वापरले जाते, म्हणून येथे फक्त ही पद्धत तपशीलवार सादर केली जाईल.

2-ΔΔct पद्धत: प्राप्त परिणाम म्हणजे प्रायोगिक गटातील लक्ष्य जनुकाच्या अभिव्यक्तीमधील फरक नियंत्रण गटातील लक्ष्य जनुकाच्या तुलनेत.हे आवश्यक आहे की लक्ष्य जनुक आणि अंतर्गत संदर्भ जनुक दोन्हीची प्रवर्धन कार्यक्षमता 100% च्या जवळ आहे आणि सापेक्ष विचलन 5% पेक्षा जास्त नसावे.

गणना पद्धत खालीलप्रमाणे आहे:

Δct नियंत्रण गट = नियंत्रण गटातील लक्ष्य जनुकाचे ct मूल्य - नियंत्रण गटातील अंतर्गत संदर्भ जनुकाचे ct मूल्य

Δct प्रायोगिक गट = प्रायोगिक गटातील लक्ष्य जनुकाचे ct मूल्य - प्रायोगिक गटातील अंतर्गत संदर्भ जनुकाचे ct मूल्य

ΔΔct=Δct प्रायोगिक गट-Δct नियंत्रण गट

शेवटी, अभिव्यक्ती पातळीतील फरकाच्या गुणाकाराची गणना करा:

Fold=2-ΔΔct बदला (एक्सेल फंक्शनशी संबंधित पॉवर आहे)

संबंधित उत्पादने:

सेल डायरेक्ट RT-qPCR किट