一, प्रतिक्रिया प्रणालीची संवेदनशीलता वाढवा:

1. उच्च दर्जाचे RNA वेगळे करा:

यशस्वी cDNA संश्लेषण उच्च-गुणवत्तेच्या RNA मधून येते.उच्च-गुणवत्तेचा RNA किमान पूर्ण-लांबीचा आणि EDTA किंवा SDS सारख्या रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेज इनहिबिटरपासून मुक्त असावा.RNA ची गुणवत्ता आपण cDNA मध्ये लिप्यंतरण करू शकणार्‍या अनुक्रम माहितीची कमाल रक्कम निर्धारित करते.सामान्य RNA शुद्धीकरण पद्धत ही ग्वानिडाइन आयसोथिओसायनेट/अॅसिड फिनॉल वापरून एक-चरण पद्धत आहे.RNase च्या ट्रेस प्रमाणाद्वारे दूषित होण्यापासून रोखण्यासाठी, RNase-समृद्ध नमुने (जसे की स्वादुपिंड) पासून वेगळे केलेले RNA उच्च-गुणवत्तेचे RNA टिकवून ठेवण्यासाठी फॉर्मल्डिहाइडमध्ये संग्रहित करणे आवश्यक आहे, विशेषतः दीर्घकालीन स्टोरेजसाठी.उंदराच्या यकृतापासून काढलेला आरएनए एक आठवडा पाण्यात ठेवल्यानंतर मुळात खराब झाला होता, तर उंदराच्या प्लीहामधून काढलेला आरएनए 3 वर्षे पाण्यात ठेवल्यानंतर स्थिर राहिला.याव्यतिरिक्त, 4 kb पेक्षा जास्त लांबीचे ट्रान्सक्रिप्ट लहान प्रतिलेखांपेक्षा ट्रेस RNases द्वारे खराब होण्यास अधिक संवेदनशील असतात.संग्रहित आरएनए नमुन्यांची स्थिरता वाढवण्यासाठी, आरएनए डीआयोनाइज्ड फॉर्मामाइडमध्ये विसर्जित केले जाऊ शकते आणि -70 डिग्री सेल्सिअस तापमानात साठवले जाऊ शकते.आरएनए टिकवण्यासाठी वापरण्यात येणारे फॉर्मामाइड हे आरएनए-डिग्रेजिंग डेब्रिजपासून मुक्त असले पाहिजे.स्वादुपिंडातील आरएनए किमान एक वर्षासाठी फॉर्मॅमाइडमध्ये संरक्षित केले जाऊ शकते.RNA वापरण्याची तयारी करत असताना, तुम्ही RNA चा अवक्षेप करण्यासाठी खालील पद्धतीचा वापर करू शकता: NaCl ला 0.2M आणि इथेनॉलच्या 4 पट जोडा, 3-5 मिनिटांसाठी खोलीच्या तपमानावर ठेवा आणि 5 मिनिटांसाठी 10,000×g वर सेंट्रीफ्यूज करा.

2. RNaseH-inactive (RNaseH-) रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस वापरा:

सीडीएनए संश्लेषणाची लांबी आणि उत्पन्न वाढवण्यासाठी रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन रिअॅक्शनमध्ये RNase इनहिबिटर सहसा जोडले जातात.RNase अवरोधक प्रथम-स्ट्रँड संश्लेषण प्रतिक्रियेदरम्यान बफर आणि कमी करणारे एजंट (जसे की DTT) च्या उपस्थितीत जोडले जावेत, कारण cDNA संश्लेषणापूर्वीची प्रक्रिया इनहिबिटरला कमी करते, ज्यामुळे RNA खराब होऊ शकते अशा बंधनकारक RNase सोडतात.प्रोटीन RNase इनहिबिटर केवळ RNase A, B, C द्वारे RNA च्या ऱ्हासास प्रतिबंध करतात आणि त्वचेवर RNase प्रतिबंधित करत नाहीत, म्हणून या इनहिबिटरचा वापर करूनही RNase आपल्या बोटांमधून येऊ नये याची काळजी घ्या.

रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस RNA चे cDNA मध्ये रूपांतरण उत्प्रेरित करते.M-MLV आणि AMV या दोन्हींमध्ये त्यांच्या स्वतःच्या पॉलिमरेज क्रियाकलापाव्यतिरिक्त अंतर्जात RNaseH क्रियाकलाप आहेत.RNaseH क्रियाकलाप आणि पॉलिमरेझ क्रियाकलाप RNA टेम्पलेट आणि DNA प्राइमर किंवा cDNA एक्स्टेंशन स्ट्रँडमध्ये तयार झालेल्या हायब्रिड स्ट्रँडसाठी एकमेकांशी स्पर्धा करतात आणि RNA:DNA कॉम्प्लेक्समध्ये RNA स्ट्रँड खराब करतात.RNaseH क्रियाकलापाने कमी केलेला RNA टेम्पलेट यापुढे cDNA संश्लेषणासाठी प्रभावी सब्सट्रेट म्हणून काम करू शकत नाही, ज्यामुळे cDNA संश्लेषणाचे उत्पन्न आणि लांबी कमी होते.म्हणून, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसची RNaseH क्रियाकलाप काढून टाकणे किंवा मोठ्या प्रमाणात कमी करणे फायदेशीर ठरेल..

सुपरस्क्रिप्ट Ⅱ रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस, RNaseH- MMLV रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस आणि थर्मोस्क्रिप्ट रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस, RNaseH- AMV, MMLV आणि AMV पेक्षा जास्त प्रमाणात आणि अधिक पूर्ण-लांबीचे cDNA मिळवू शकतात.RT-PCR संवेदनशीलता cDNA संश्लेषणाच्या प्रमाणात प्रभावित होईल.थर्मोस्क्रिप्ट AMV पेक्षा जास्त संवेदनशील आहे.RT-PCR उत्पादनांचा आकार सीडीएनएचे संश्लेषण करण्यासाठी रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसच्या क्षमतेद्वारे मर्यादित आहे, विशेषत: मोठ्या सीडीएनएचे क्लोनिंग करताना.MMLV च्या तुलनेत, SuperScripⅡ ने लांब RT-PCR उत्पादनांच्या उत्पन्नात लक्षणीय वाढ केली आहे.RNaseH-रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसमध्ये देखील थर्मोस्टॅबिलिटी वाढली आहे, त्यामुळे प्रतिक्रिया सामान्य 37-42°C पेक्षा जास्त तापमानात केली जाऊ शकते.सुचविलेल्या संश्लेषण परिस्थितीनुसार, oligo(dT) प्राइमर आणि [α-P]dCTP चे 10 μCi वापरा.पहिल्या स्ट्रँडचे एकूण उत्पन्न TCA पर्जन्य पद्धत वापरून मोजले गेले.पूर्ण-लांबीच्या सीडीएनएचे विश्लेषण आकारानुसार क्रमवारी लावलेले बँड वापरून केले गेले आणि अल्कधर्मी अॅग्रोज जेलवर मोजले गेले.

3. रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनसाठी उष्मायन तापमान वाढवा:

उच्च उष्मायन तापमान RNA दुय्यम संरचना उघडण्यास मदत करते, प्रतिक्रियेचे उत्पन्न वाढवते.बर्‍याच RNA टेम्पलेट्ससाठी, RNA आणि प्राइमर्सना बफर किंवा मीठाशिवाय 65°C तापमानावर उष्मायन केल्याने, त्यानंतर बर्फावर जलद थंडीमुळे बहुतेक दुय्यम संरचना नष्ट होतील आणि प्राइमर्स बांधता येतील.तथापि, उष्णतेच्या विकृतीनंतरही काही टेम्पलेट्समध्ये दुय्यम संरचना आहेत.थर्मोस्क्रिप्ट रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस वापरून या कठीण टेम्प्लेट्सचे प्रवर्धन केले जाऊ शकते आणि प्रवर्धन सुधारण्यासाठी रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रतिक्रिया उच्च तापमानावर ठेवली जाऊ शकते.उच्च उष्मायन तापमान देखील विशिष्टता वाढवू शकते, विशेषत: जेव्हा सीडीएनए संश्लेषणासाठी जीन-विशिष्ट प्राइमर्स (जीएसपी) वापरले जातात (धडा 3 पहा).GSP वापरत असल्यास, प्राइमरचा Tm अपेक्षित उष्मायन तापमानाप्रमाणे आहे याची खात्री करा.60°C वरील oligo(dT) आणि यादृच्छिक प्राइमर वापरू नका.यादृच्छिक प्राइमर्सना 60°C पर्यंत वाढण्यापूर्वी 10 मिनिटांसाठी 25°C वर उष्मायन आवश्यक असते.उच्च रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन तापमान वापरण्याव्यतिरिक्त, RNA/प्राइमर मिक्स थेट 65°C denaturation तापमानापासून रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन उष्मायन तापमानात हस्तांतरित करून आणि प्री-वॉर्म्ड 2× प्रतिक्रिया मिश्रण (cDNA हॉट-स्टार्ट सिंथेसिस) जोडून विशिष्टता सुधारली जाऊ शकते.हा दृष्टीकोन कमी तापमानात होणार्‍या इंटरमॉलिक्युलर बेस पेअरिंगला प्रतिबंध करण्यास मदत करतो.RT-PCR साठी आवश्यक असलेले एकाधिक तापमान स्विचिंग थर्मल सायकलर वापरून सोपे केले जाऊ शकते.

Tth थर्मोस्टेबल पॉलिमरेझ Mg2+ च्या उपस्थितीत DNA पॉलिमरेझ आणि Mn2+ च्या उपस्थितीत RNA पॉलिमरेझ म्हणून कार्य करते.ते कमाल 65 डिग्री सेल्सिअस तापमानात उबदार ठेवता येते.तथापि, PCR दरम्यान Mn2+ ची उपस्थिती निष्ठा कमी करते, ज्यामुळे उच्च-परिशुद्धता प्रवर्धन, जसे की cDNA च्या क्लोनिंगसाठी Tth पॉलिमरेझ कमी योग्य बनते.याव्यतिरिक्त, Tth मध्ये कमी रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन कार्यक्षमता आहे, ज्यामुळे संवेदनशीलता कमी होते आणि, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन आणि PCR एकाच एन्झाइमसह केले जाऊ शकतात, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनशिवाय नियंत्रण प्रतिक्रियांचा वापर जीनोमिक डीएनए दूषित करणार्या सीडीएनए प्रवर्धन उत्पादनांची तुलना करण्यासाठी केला जाऊ शकत नाही.प्रवर्धन उत्पादने वेगळे केले गेले.

4. रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनला प्रोत्साहन देणारे अॅडिटीव्ह:

ग्लिसरॉल आणि डीएमएसओसह ऍडिटिव्ह्ज फर्स्ट-स्ट्रँड सिंथेसिस रिअॅक्शनमध्ये जोडले जातात, ज्यामुळे न्यूक्लिक अॅसिड डबल-स्ट्रँडची स्थिरता कमी होते आणि आरएनएची दुय्यम रचना बंद होते.सुपरस्क्रिप्ट II किंवा MMLV क्रियाकलाप प्रभावित न करता 20% पर्यंत ग्लिसरॉल किंवा 10% DMSO जोडले जाऊ शकते.AMV 20% पर्यंत ग्लिसरॉल देखील सहन करू शकते, क्रियाकलाप न गमावता.सुपरस्क्रिप्टⅡ रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन रिअॅक्शनमध्ये RT-PCR ची संवेदनशीलता जास्तीत जास्त वाढवण्यासाठी, 10% ग्लिसरॉल जोडले जाऊ शकते आणि 45°C वर उष्मायन केले जाऊ शकते.जर रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन रिअॅक्शन उत्पादनाचा 1/10 पीसीआरमध्ये जोडला गेला असेल, तर अॅम्प्लीफिकेशन रिअॅक्शनमध्ये ग्लिसरॉलची एकाग्रता 0.4% आहे, जी पीसीआरला रोखण्यासाठी पुरेसे नाही.

5. RNaseH उपचार:

PCR पूर्वी RNaseH सह cDNA संश्लेषण प्रतिक्रियांचे उपचार केल्याने संवेदनशीलता वाढू शकते.काही टेम्प्लेट्ससाठी, असे मानले जाते की सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रियेतील आरएनए प्रवर्धन उत्पादनांचे बंधन प्रतिबंधित करते, अशा परिस्थितीत RNaseH उपचार संवेदनशीलता वाढवू शकतात.सामान्यतः, कमी-कॉपी ट्यूबरस स्केरोसिस II सारख्या दीर्घ पूर्ण-लांबीच्या cDNA लक्ष्य टेम्पलेट्स वाढवताना RNaseH उपचार आवश्यक असतात.या कठीण टेम्प्लेटसाठी, RNaseH उपचाराने सुपरस्क्रिप्ट II किंवा AMV-संश्लेषित cDNA द्वारे उत्पादित सिग्नल वर्धित केले.बर्‍याच RT-PCR प्रतिक्रियांसाठी, RNaseH उपचार पर्यायी आहे, कारण PCR विकृतीकरण पायरी 95°C वर साधारणपणे RNA:DNA कॉम्प्लेक्समधील RNA चे हायड्रोलायझेशन करते.

6. लहान आरएनए शोध पद्धतीत सुधारणा:

आरटी-पीसीआर विशेषतः आव्हानात्मक असते जेव्हा फक्त थोड्या प्रमाणात आरएनए उपलब्ध असते.RNA अलगाव दरम्यान वाहक म्हणून जोडलेले ग्लायकोजेन लहान नमुन्यांचे उत्पन्न वाढवण्यास मदत करते.RNase-मुक्त ग्लायकोजेन ट्रायझोल जोडण्याबरोबरच जोडले जाऊ शकते.ग्लायकोजेन हे पाण्यात विरघळणारे आहे आणि त्यानंतरच्या पर्जन्यवृष्टीला मदत करण्यासाठी RNA सह जलीय अवस्थेत ठेवता येते.50 मिलीग्राम ऊती किंवा 106 संवर्धित पेशींपेक्षा कमी नमुन्यांसाठी, RNase-मुक्त ग्लायकोजेनची शिफारस केलेली एकाग्रता 250 μg/ml आहे.

सुपरस्क्रिप्ट II वापरून रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन रिअॅक्शनमध्ये एसिटाइलेटेड BSA जोडल्याने संवेदनशीलता वाढू शकते आणि आरएनएच्या थोड्या प्रमाणात, सुपरस्क्रिप्ट II चे प्रमाण कमी करून आणि RNaseOut न्यूक्लीज इनहिबिटरची 40 युनिट्स जोडल्याने ओळख पातळी वाढू शकते.आरएनए अलगाव प्रक्रियेत ग्लायकोजेन वापरल्यास, उलट प्रतिलेखन प्रतिक्रियेसाठी सुपरस्क्रिप्ट II वापरताना BSA किंवा RNase इनहिबिटर जोडण्याची शिफारस केली जाते.

二、RT-PCR विशिष्टता वाढवा

1. CND अॅसिंथेसिस:

फर्स्ट-स्ट्रँड सीडीएनए संश्लेषण तीन वेगवेगळ्या पद्धती वापरून सुरू केले जाऊ शकते, ज्याची सापेक्ष विशिष्टता संश्लेषित सीडीएनएचे प्रमाण आणि प्रकार प्रभावित करते.

यादृच्छिक प्राइमर पद्धत तीन पद्धतींपैकी सर्वात कमी विशिष्ट होती.प्राइमर संपूर्ण उतार्‍यावर एकाधिक साइटवर एनील करतात, लहान, आंशिक-लांबीचे cDNA तयार करतात.ही पद्धत वारंवार 5′ शेवटचे अनुक्रम प्राप्त करण्यासाठी आणि दुय्यम संरचनेच्या क्षेत्रांसह किंवा रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसद्वारे प्रतिकृती बनवता येणार नाही अशा टर्मिनेशन साइटसह RNA टेम्पलेट्समधून cDNA प्राप्त करण्यासाठी वापरली जाते.सर्वात लांब सीडीएनए मिळविण्यासाठी, प्रत्येक आरएनए नमुन्यातील प्राइमर्सचे आरएनए आणि प्राइमरीचे गुणोत्तर प्रायोगिकरित्या निर्धारित करणे आवश्यक आहे.यादृच्छिक प्राइमर्सची सुरुवातीची एकाग्रता 50 ते 250 एनजी प्रति 20 μl प्रतिक्रियेपर्यंत होती.यादृच्छिक प्राइमर्स वापरून एकूण RNA मधून संश्लेषित केलेले cDNA हे प्रामुख्याने ribosomal RNA असल्याने, पॉली(A)+RNA हे साधारणपणे टेम्पलेट म्हणून निवडले जाते.

ऑलिगो(डीटी) प्राइमर्स यादृच्छिक प्राइमर्सपेक्षा अधिक विशिष्ट असतात.हे बहुतेक युकेरियोटिक mRNAs च्या 3′ शेवटी आढळणाऱ्या पॉली(A) शेपटीला संकरित करते.पॉली(ए)+ आरएनए एकूण आरएनएच्या अंदाजे 1% ते 2% असल्याने, सीडीएनएचे प्रमाण आणि जटिलता यादृच्छिक प्राइमर्सच्या तुलनेत खूपच कमी आहे.त्याच्या उच्च विशिष्टतेमुळे, oligo(dT) ला सामान्यतः प्राइमर्स आणि पॉली(A)+ निवडीचे RNA चे गुणोत्तर ऑप्टिमायझेशनची आवश्यकता नसते.प्रति 20μl प्रतिक्रिया प्रणाली 0.5μg oligo(dT) वापरण्याची शिफारस केली जाते.oligo(dT)12-18 बहुतेक RT-PCR साठी योग्य आहे.थर्मोस्क्रिप्ट आरटी-पीसीआर प्रणाली उच्च उष्मायन तापमानासाठी उत्तम थर्मल स्थिरतेमुळे oligo(dT)20 देते.

जीन स्पेसिफिक प्राइमर्स (GSP) हे रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन स्टेपसाठी सर्वात विशिष्ट प्राइमर्स आहेत.जीएसपी हे अँटीसेन्स ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड आहे जे सर्व आरएनएला जोडणारे यादृच्छिक प्राइमर्स किंवा ऑलिगो(डीटी) विपरीत, आरएनए लक्ष्य अनुक्रमात विशेषतः संकरित करू शकते.PCR प्राइमर्स डिझाइन करण्यासाठी वापरलेले समान नियम रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रतिक्रियांमध्ये GSP च्या डिझाइनवर लागू होतात.जीएसपी हा एमआरएनएच्या 3′-सर्वात टोकाला जोडणारा एम्प्लीफिकेशन प्राइमर सारखाच क्रम असू शकतो किंवा जीएसपी रिव्हर्स अॅम्प्लीफिकेशन प्राइमरच्या डाउनस्ट्रीमला जोडण्यासाठी डिझाइन केले जाऊ शकते.काही प्रवर्धित विषयांसाठी, यशस्वी RT-PCR साठी एकापेक्षा जास्त अँटिसेन्स प्राइमर डिझाइन करणे आवश्यक आहे कारण लक्ष्य RNA ची दुय्यम रचना प्राइमर बंधनास प्रतिबंध करू शकते.20 μl प्रथम-स्ट्रँड संश्लेषण प्रतिक्रियेमध्ये 1 pmol antisense GSP वापरण्याची शिफारस केली जाते.

2. रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनसाठी उष्मायन तापमान वाढवा:

GSP विशिष्टतेचा पूर्ण फायदा घेण्यासाठी, उच्च थर्मोस्टॅबिलिटीसह रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसचा वापर केला पाहिजे.प्रतिक्रिया कडकपणा वाढवण्यासाठी थर्मोस्टेबल रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस उच्च तापमानात उष्मायन केले जाऊ शकतात.उदाहरणार्थ, जर GSP 55°C वर बंद होत असेल तर, AMV किंवा M-MLV 37°C च्या कमी कडकपणावर रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनसाठी वापरल्यास GSP ची विशिष्टता पूर्णपणे वापरली जाणार नाही.तथापि, SuperScript II आणि ThermoScript 50°C किंवा त्याहून अधिक तापमानावर प्रतिक्रिया देऊ शकतात, ज्यामुळे कमी तापमानात निर्माण होणारी विशिष्ट नसलेली उत्पादने दूर होतील.जास्तीत जास्त विशिष्टतेसाठी, RNA/प्राइमर मिक्स थेट 65°C denaturation तापमानापासून रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन उष्मायन तापमानात हस्तांतरित केले जाऊ शकते आणि प्री-वॉर्म्ड 2× प्रतिक्रिया मिश्रण (cDNA संश्लेषण हॉट स्टार्ट) मध्ये जोडले जाऊ शकते.हे कमी तापमानात इंटरमॉलिक्युलर बेस पेअरिंग टाळण्यास मदत करते.RT-PCR साठी आवश्यक असलेले अनेक तापमान संक्रमण थर्मल सायकलर वापरून सोपे केले जाऊ शकते.

3. जीनोमिक डीएनए दूषितता कमी करते:

आरटी-पीसीआरमध्ये संभाव्य अडचण म्हणजे आरएनएमधील जीनोमिक डीएनए दूषित होणे.ट्रायझोल अभिकर्मक सारख्या चांगल्या RNA पृथक्करण पद्धतीचा वापर केल्याने RNA तयारीला दूषित करणार्‍या जीनोमिक डीएनएचे प्रमाण कमी होईल.जीनोमिक डीएनए मधून मिळवलेली उत्पादने टाळण्यासाठी, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनच्या अगोदर दूषित डीएनए काढून टाकण्यासाठी प्रवर्धक-श्रेणी DNase I ने RNA चा उपचार केला जाऊ शकतो.DNase I पचन 2.0 mM EDTA मध्ये 10 मिनिटे 65°C तापमानावर उष्मायन करून संपुष्टात आले.EDTA मॅग्नेशियम आयन चेलेट करू शकते, उच्च तापमानात मॅग्नेशियम आयन-आश्रित आरएनए हायड्रोलिसिस प्रतिबंधित करते.

प्रवर्धित सीडीएनएला जीनोमिक डीएनए प्रवर्धक उत्पादनांना दूषित करण्यापासून वेगळे करण्यासाठी, प्राइमर असे डिझाइन केले जाऊ शकतात की प्रत्येक अॅनिल एक्सॉन्स वेगळे करेल.cDNA मधून मिळवलेली PCR उत्पादने दूषित जीनोमिक DNA मधून मिळवलेली उत्पादने कमी असतील.याव्यतिरिक्त, दिलेला तुकडा जीनोमिक DNA किंवा cDNA मधून घेतला गेला आहे की नाही हे निर्धारित करण्यासाठी प्रत्येक RNA टेम्पलेटवर उलट प्रतिलेखन न करता नियंत्रण प्रयोग केले गेले.रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनशिवाय मिळवलेले पीसीआर उत्पादन जीनोममधून घेतले जाते.