RT-qPCR सामान्य पीसीआर तंत्रज्ञानापासून विकसित केले आहे.हे पारंपारिक पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणालीमध्ये फ्लोरोसेंट रसायने (फ्लोरोसंट रंग किंवा फ्लोरोसेंट प्रोब) जोडते आणि त्यांच्या वेगवेगळ्या ल्युमिनेसेंट यंत्रणेनुसार रिअल टाइममध्ये पीसीआर अॅनिलिंग आणि विस्तार प्रक्रिया शोधते.PCR च्या प्रत्येक चक्रामध्ये उत्पादनातील बदलांची गणना करण्यासाठी माध्यमातील फ्लोरोसेंट सिग्नल बदलांचा वापर केला जातो.सध्या, सर्वात सामान्य पद्धती म्हणजे फ्लोरोसेंट डाई पद्धत आणि प्रोब पद्धत.

फ्लोरोसेंट डाई पद्धत:
काही फ्लोरोसेंट रंग, जसे की SYBR ग्रीन Ⅰ, PicoGreen, BEBO, इत्यादी, स्वतःहून प्रकाश उत्सर्जित करत नाहीत, परंतु dsDNA च्या किरकोळ खोबणीला बांधल्यानंतर प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करतात.म्हणून, पीसीआर प्रतिक्रियेच्या सुरूवातीस, मशीन फ्लोरोसेंट सिग्नल शोधू शकत नाही.जेव्हा प्रतिक्रिया अॅनिलिंग-विस्तार (दोन-चरण पद्धत) किंवा विस्तार टप्प्यावर (तीन-चरण पद्धत) पुढे जाते, तेव्हा दुहेरी स्ट्रँड उघडले जातात आणि नवीन डीएनए पॉलिमरेझ स्ट्रँड संश्लेषणादरम्यान, फ्लूरोसंट रेणू dsDNA मायनर ग्रूव्हमध्ये एकत्र केले जातात आणि फ्लूरेन्स उत्सर्जित होतात.पीसीआर चक्रांची संख्या जसजशी वाढत जाते, तसतसे अधिकाधिक रंग dsDNA बरोबर एकत्रित होतात आणि फ्लोरोसेंट सिग्नल देखील सतत वर्धित केला जातो.उदाहरण म्हणून SYBR ग्रीन Ⅰ घ्या.
तपासणी पद्धत:
ताकमान प्रोब हा सर्वात जास्त वापरला जाणारा हायड्रोलिसिस प्रोब आहे.प्रोबच्या 5′ शेवटी एक फ्लोरोसेंट गट असतो, सामान्यतः FAM.प्रोब स्वतः लक्ष्य जनुकाला पूरक असा क्रम आहे.फ्लोरोफोरच्या 3′ शेवटी एक फ्लोरोसेंट शमन गट आहे.फ्लूरोसेन्स रेझोनान्स एनर्जी ट्रान्सफर (Förster रेझोनान्स एनर्जी ट्रान्सफर, FRET) च्या तत्त्वानुसार, जेव्हा रिपोर्टर फ्लोरोसेंट ग्रुप (दाता फ्लोरोसेंट रेणू) आणि क्वेंचिंग फ्लूरोसंट ग्रुप (स्वीकारणारा फ्लोरोसेंट रेणू) जेव्हा एक्सिटेशन स्पेक्ट्रम ओव्हरलॅप होतो आणि अंतर खूप जवळ असते तेव्हा एक्सिटेशन स्पेक्ट्रम 7 च्या जवळ असते. स्वीकारकर्ता रेणूचा फ्लूरोसेन्स, तर ऑटोफ्लोरेसेन्स कमकुवत झाला आहे.म्हणून, पीसीआर प्रतिक्रियेच्या सुरूवातीस, जेव्हा सिस्टममध्ये प्रोब मुक्त आणि अखंड असेल, तेव्हा रिपोर्टर फ्लोरोसेंट ग्रुप फ्लूरोसेन्स उत्सर्जित करणार नाही.एनीलिंग करताना, प्राइमर आणि प्रोब टेम्पलेटशी बांधले जातात.विस्ताराच्या अवस्थेत, पॉलिमरेज सतत नवीन साखळ्यांचे संश्लेषण करते.DNA पॉलिमरेझमध्ये 5′-3′ exonuclease क्रियाकलाप आहे.प्रोबपर्यंत पोहोचताना, डीएनए पॉलिमरेज टेम्प्लेटमधून प्रोबचे हायड्रोलायझ करेल, रिपोर्टर फ्लोरोसेंट ग्रुपला क्वेन्चर फ्लूरोसंट ग्रुपपासून वेगळे करेल आणि फ्लोरोसेंट सिग्नल सोडेल.प्रोब आणि टेम्प्लेट यांच्यात एक-एक संबंध असल्याने, चाचणीची अचूकता आणि संवेदनशीलतेच्या बाबतीत प्रोब पद्धत डाई पद्धतीपेक्षा श्रेष्ठ आहे.

अंजीर 1 qRT-PCR चे तत्व

प्राइमर डिझाइन
तत्त्वे:

प्राइमर्सची रचना न्यूक्लिक अॅसिड मालिकेच्या संरक्षित प्रदेशात केली गेली पाहिजे आणि त्यांची विशिष्टता असावी.

सीडीएनए अनुक्रम वापरणे सर्वोत्तम आहे आणि एमआरएनए अनुक्रम देखील स्वीकार्य आहे.नसल्यास, डीएनए अनुक्रमाची सीडीएस क्षेत्राची रचना शोधा.
फ्लोरोसेंट परिमाणवाचक उत्पादनाची लांबी 80-150bp आहे, सर्वात लांब 300bp आहे, प्राइमरची लांबी साधारणपणे 17-25 बेस्स दरम्यान असते आणि अपस्ट्रीम आणि डाउनस्ट्रीम प्राइमरमधील फरक फार मोठा नसावा.

G+C सामग्री 40% आणि 60% दरम्यान आहे आणि 45-55% सर्वोत्तम आहे.
टीएम मूल्य 58-62 अंशांच्या दरम्यान आहे.
प्राइमर डायमर आणि सेल्फ-डायमर टाळण्याचा प्रयत्न करा, (लगातार पूरक बेसच्या 4 जोड्या पेक्षा जास्त दिसू नका) हेअरपिन स्ट्रक्चर, अपरिहार्य असल्यास, ΔG<4.5kJ/mol* करा रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन क्लीन दरम्यान gDNA काढले गेले आहे याची खात्री न केल्यास, इंट्रोनचे प्राइमर्स डिझाइन करणे चांगले आहे, GAT टाळू शकत नाही, T′ मॉड क्षेत्र टाळू शकत नाही. /C, A/G सतत संरचना (2-3) प्राइमर्स आणि गैर-
विशिष्ट विषम प्रवर्धित अनुक्रमाचे समरूपशास्त्र शक्यतो ७०% पेक्षा कमी असते किंवा 8 पूरक आधारभूत समरूपता असते.
डेटाबेस:
कॉटनएफजीडी कीवर्डद्वारे शोधा
प्राइमर डिझाइन:
IDT-qPCR प्राइमर डिझाइन

Fig2 IDT ऑनलाइन प्राइमर डिझाइन टूल पृष्ठ

Fig3 परिणाम पृष्ठ प्रदर्शन
lncRNA प्राइमर्सची रचना:
lncRNA:mRNA सारख्याच पायऱ्या.
miRNA:स्टेम-लूप पद्धतीचे तत्त्व: सर्व miRNAs सुमारे 23 nt चे लहान अनुक्रम असल्याने, थेट पीसीआर शोधणे शक्य नाही, म्हणून स्टेम-लूप अनुक्रम साधन वापरले जाते.स्टेम-लूप अनुक्रम हा सुमारे 50 एनटीचा सिंगल-स्ट्रँडेड डीएनए आहे, जो स्वतःच एक केसांची रचना बनवू शकतो.3 'शेवटला miRNA आंशिक तुकड्याला पूरक अनुक्रम म्हणून डिझाइन केले जाऊ शकते, नंतर लक्ष्य miRNA रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन दरम्यान स्टेम-लूप सीक्वेन्सशी कनेक्ट केले जाऊ शकते आणि एकूण लांबी 70bp पर्यंत पोहोचू शकते, जी qPCR द्वारे निर्धारित प्रवर्धित उत्पादनाच्या लांबीच्या अनुरूप आहे.टेलिंग miRNA प्राइमर डिझाइन.
प्रवर्धन-विशिष्ट शोध:
ऑनलाइन ब्लास्ट डेटाबेस: अनुक्रम समानतेनुसार कॉटनएफजीडी विस्फोट
लोकल ब्लास्ट: स्थानिक ब्लास्ट करण्यासाठी ब्लास्ट+ वापरण्याचा संदर्भ घ्या, लिनक्स आणि मॅकोस थेट स्थानिक डेटाबेस स्थापित करू शकतात, उबंटू बॅश स्थापित केल्यानंतर win10 सिस्टम देखील केले जाऊ शकते.स्थानिक स्फोट डेटाबेस आणि स्थानिक स्फोट तयार करा;win10 वर उबंटू बॅश उघडा.
सूचना: उंचावरील कापूस आणि समुद्र बेटातील कापूस ही टेट्राप्लॉइड पिके आहेत, त्यामुळे स्फोटाचे परिणाम दोन किंवा अधिक जुळणारे असतील.भूतकाळात, स्फोट करण्यासाठी डेटाबेस म्हणून एनएयू सीडीचा वापर केल्याने केवळ काही एसएनपी फरकांसह दोन एकसमान जीन्स मिळण्याची शक्यता होती.सहसा, दोन समरूप जनुकांना प्राइमर डिझाइनद्वारे वेगळे केले जाऊ शकत नाही, म्हणून त्यांना समान मानले जाते.जर स्पष्ट इंडेल असेल तर, प्राइमरची रचना सामान्यतः इंडेलवर केली जाते, परंतु यामुळे प्राइमरची दुय्यम रचना होऊ शकते मुक्त ऊर्जा जास्त होते, ज्यामुळे प्रवर्धन कार्यक्षमतेत घट होते, परंतु हे अटळ आहे.

प्राइमर दुय्यम संरचना शोधणे:
पायऱ्या:ओलिगो 7 → इनपुट टेम्पलेट क्रम उघडा → उप-विंडो बंद करा → सेव्ह करा → टेम्प्लेटवर प्राइमर शोधा, प्राइमरची लांबी सेट करण्यासाठी ctrl+D दाबा → विविध दुय्यम संरचनांचे विश्लेषण करा, जसे की सेल्फ-डायमरायझेशन बॉडी, हेटरोडाइमर, हेअरपिन, मिसमॅच, इ. आकृती 4 मधील शेवटची दोन चित्रे प्राइम ची आहेत.समोरील प्राइमरचा परिणाम चांगला आहे, कोणतेही स्पष्ट डायमर आणि हेअरपिन संरचना नाही, सतत पूरक आधार नाहीत आणि मुक्त उर्जेचे परिपूर्ण मूल्य 4.5 पेक्षा कमी आहे, तर मागील प्राइमर सतत दर्शविते 6 बेस पूरक आहेत आणि मुक्त ऊर्जा 8.8 आहे;याव्यतिरिक्त, 3′ शेवटी एक अधिक गंभीर डायमर दिसून येतो आणि 4 सलग बेसचा डायमर दिसून येतो.मुक्त ऊर्जा जास्त नसली तरी, 3′ dimer Chl प्रवर्धन विशिष्टता आणि प्रवर्धन कार्यक्षमतेवर गंभीरपणे परिणाम करू शकते.याव्यतिरिक्त, हेअरपिन, हेटरोडाइमर्स आणि विसंगती तपासणे आवश्यक आहे.

Fig3 oligo7 शोध परिणाम
प्रवर्धन कार्यक्षमता ओळख:
पीसीआर प्रतिक्रियेची प्रवर्धन कार्यक्षमता पीसीआर परिणामांवर गंभीरपणे परिणाम करते.तसेच qRT-PCR मध्ये, परिमाणवाचक परिणामांसाठी प्रवर्धन कार्यक्षमता विशेषतः महत्वाची आहे.प्रतिक्रिया बफरमधील इतर पदार्थ, मशीन आणि प्रोटोकॉल काढा.प्राइमर्सच्या गुणवत्तेचा देखील qRT-PCR च्या प्रवर्धन कार्यक्षमतेवर मोठा प्रभाव असतो.परिणामांची अचूकता सुनिश्चित करण्यासाठी, सापेक्ष प्रतिदीप्ति प्रमाणीकरण आणि परिपूर्ण प्रतिदीप्ति प्रमाणीकरण या दोन्हींना प्राइमर्सची प्रवर्धन कार्यक्षमता शोधणे आवश्यक आहे.हे ओळखले जाते की प्रभावी qRT-PCR प्रवर्धन कार्यक्षमता 85% आणि 115% दरम्यान आहे.दोन पद्धती आहेत:
1. मानक वक्र पद्धत:
aसीडीएनए मिक्स करा
bग्रेडियंट सौम्य करणे
c.qPCR
dप्रवर्धन कार्यक्षमतेची गणना करण्यासाठी रेखीय प्रतिगमन समीकरण
2. LinRegPCR
LinRegPCR हा रिअल टाइम RT-PCR डेटाच्या विश्लेषणासाठी एक कार्यक्रम आहे, ज्याला SYBR ग्रीन किंवा तत्सम रसायनशास्त्रावर आधारित परिमाणात्मक PCR (qPCR) डेटा देखील म्हणतात.प्रोग्राम नॉन-बेसलाइन दुरुस्त केलेला डेटा वापरतो, प्रत्येक नमुन्यावर बेसलाइन सुधारणा स्वतंत्रपणे करतो, विंडो-ऑफ-लाइनरिटी निर्धारित करतो आणि नंतर PCR डेटा सेटद्वारे सरळ रेषेमध्ये बसण्यासाठी रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण वापरतो.या ओळीच्या उतारावरून प्रत्येक वैयक्तिक नमुन्याची पीसीआर कार्यक्षमता मोजली जाते.प्रति अॅम्प्लिकॉन सरासरी PCR कार्यक्षमता आणि प्रति नमुन्यासाठी Ct मूल्य प्रति नमुन्यातील सुरुवातीच्या एकाग्रतेची गणना करण्यासाठी वापरले जाते, जे अनियंत्रित फ्लोरोसेन्स युनिट्समध्ये व्यक्त केले जाते.डेटा इनपुट आणि आउटपुट एक्सेल स्प्रेडशीटद्वारे आहे.फक्त नमुना
मिश्रण आवश्यक आहे, ग्रेडियंट नाही
पायऱ्या आवश्यक आहेत:(उदाहरणार्थ बोले CFX96 घ्या, स्पष्ट ABI सह मशीन नाही)
प्रयोग:हा एक मानक qPCR प्रयोग आहे.
qPCR डेटा आउटपुट:LinRegPCR आउटपुट फाइल्सचे दोन प्रकार ओळखू शकते: RDML किंवा क्वांटिफिकेशन अॅम्प्लिफिकेशन परिणाम.खरं तर, हे मशीनद्वारे सायकल क्रमांक आणि फ्लूरोसेन्स सिग्नलचे रिअल-टाइम डिटेक्शन मूल्य आहे आणि रेखीय विभाग कार्यक्षमतेच्या फ्लूरोसेन्स बदल मूल्याचे विश्लेषण करून प्रवर्धन प्राप्त केले जाते.
डेटा निवड: सिद्धांतानुसार, RDML मूल्य वापरण्यायोग्य असावे.असा अंदाज आहे की माझ्या संगणकाची समस्या ही आहे की सॉफ्टवेअर RDML ओळखू शकत नाही, म्हणून माझ्याकडे मूळ डेटा म्हणून एक्सेल आउटपुट मूल्य आहे.प्रथम डेटाचे रफ स्क्रीनिंग करण्याची शिफारस केली जाते, जसे की नमुने जोडण्यात अयशस्वी होणे इ. आउटपुट डेटामध्ये पॉइंट हटवले जाऊ शकतात (अर्थात, तुम्ही ते हटवू शकत नाही, LinRegPCR नंतरच्या टप्प्यात या मुद्द्यांकडे दुर्लक्ष करेल)

Fig5 qPCR डेटा निर्यात

Fig6 उमेदवारांच्या नमुन्यांची निवड

डेटा इनपुट:ओपन क्वालिफिकेशन अॅम्प्लीफिकेशन results.xls, → उघडा LinRegPCR → फाइल → एक्सेल मधून वाचा → आकृती 7 मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे पॅरामीटर्स निवडा → ओके → बेसलाइन निर्धारित करा क्लिक करा

linRegPCR डेटा इनपुटचे Fig7 चरण

परिणाम:पुनरावृत्ती नसल्यास, कोणत्याही गटाची आवश्यकता नाही.जर पुनरावृत्ती होत असेल तर, नमुना गटात गटबद्धता संपादित केली जाऊ शकते आणि जनुकाचे नाव अभिज्ञापकामध्ये प्रविष्ट केले जाते आणि नंतर समान जनुक आपोआप गटबद्ध केले जाईल.शेवटी, फाईलवर क्लिक करा, एक्सेल निर्यात करा आणि परिणाम पहा.प्रत्येक विहिरीचे प्रवर्धन कार्यक्षमता आणि R2 परिणाम प्रदर्शित केले जातील.दुसरे म्हणजे, आपण गटांमध्ये विभागल्यास, सुधारित सरासरी प्रवर्धन कार्यक्षमता प्रदर्शित केली जाईल.प्रत्येक प्राइमरची प्रवर्धन कार्यक्षमता 85% आणि 115% च्या दरम्यान असल्याची खात्री करा.जर ते खूप मोठे किंवा खूप लहान असेल तर याचा अर्थ प्राइमरची प्रवर्धन कार्यक्षमता खराब आहे.

अंजीर 8 परिणाम आणि डेटा आउटपुट

प्रायोगिक प्रक्रिया:
आरएनए गुणवत्ता आवश्यकता:
पवित्रता:१.७2.0 हे सूचित करते की अवशिष्ट आयसोथियोसायनेट असू शकते.क्लीन न्यूक्लिक अॅसिड A260/A230 2 च्या आसपास असावे .230 nm वर मजबूत शोषण असल्यास, हे सूचित करते की फेनेट आयनसारखे सेंद्रिय संयुगे आहेत.याव्यतिरिक्त, हे 1.5% ऍग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसद्वारे शोधले जाऊ शकते.मार्कर दर्शवा, कारण ssRNA मध्ये कोणतेही विकृतीकरण नाही आणि आण्विक वजन लॉगरिथमचा एक रेषीय संबंध नाही आणि आण्विक वजन योग्यरित्या व्यक्त केले जाऊ शकत नाही.एकाग्रता: सैद्धांतिकदृष्ट्यानाही100ng/ul पेक्षा कमी, एकाग्रता खूप कमी असल्यास, शुद्धता सामान्यतः कमी असते उंच नाही

Fig9 RNA जेल

याशिवाय, जर नमुना मौल्यवान असेल आणि RNA एकाग्रता जास्त असेल, तर निष्कर्ष काढल्यानंतर ते अलिकोट करण्याची शिफारस केली जाते आणि उलट प्रतिलेखनासाठी RNA 100-300ng/ul च्या अंतिम एकाग्रतेपर्यंत पातळ करण्याची शिफारस केली जाते.मध्येउलट प्रतिलेखन प्रक्रिया, जेव्हा mRNA लिप्यंतरण केले जाते तेव्हा, oligo (dt) प्राइमर्स जे विशेषतः polyA टेलला बांधू शकतात ते रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनसाठी वापरले जातात, तर lncRNA आणि circRNA एकूण RNA च्या रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनसाठी यादृच्छिक हेक्सामर (रँडम 6 mer) प्राइमर वापरतात.अनेक कंपन्यांनी आता स्पेशल टेलिंग किट्स लाँच केल्या आहेत.स्टेम-लूप पद्धतीसाठी, टेलिंग पद्धत अधिक सोयीस्कर, उच्च-थ्रूपुट आणि अभिकर्मक-बचत आहे, परंतु समान कुटुंबातील miRNAs वेगळे करण्याचा परिणाम स्टेम-लूप पद्धतीइतका चांगला नसावा.प्रत्येक रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन किटमध्ये जनुक-विशिष्ट प्राइमर्स (स्टेम-लूप) च्या एकाग्रतेसाठी आवश्यकता असते.miRNA साठी वापरलेला अंतर्गत संदर्भ U6 आहे.स्टेम-लूप उलथापालथ करण्याच्या प्रक्रियेत, U6 ची एक ट्यूब स्वतंत्रपणे उलट केली पाहिजे आणि U6 चे पुढील आणि मागील प्राइमर थेट जोडले जावे.circRNA आणि lncRNA दोन्ही HKGs अंतर्गत संदर्भ म्हणून वापरू शकतात.मध्येcDNA ओळख,
RNA मध्ये समस्या नसल्यास, cDNA देखील ठीक असणे आवश्यक आहे.तथापि, प्रयोगाच्या परिपूर्णतेचा पाठपुरावा केल्यास, अंतर्गत संदर्भ जनुक (संदर्भ जीन, आरजी) वापरणे चांगले आहे जे सीडीएसपासून जीडीएनए वेगळे करू शकते.सामान्यतः, आरजी हा एक गृहनिर्माण जनुक आहे., HKG) आकृती 10 मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे;त्यावेळी, मी सोयाबीन स्टोरेज प्रोटीन बनवत होतो आणि अंतर्गत संदर्भ म्हणून इंट्रोन्स असलेले actin7 वापरले.gDNA मध्ये या प्राइमरच्या प्रवर्धित तुकड्याचा आकार 452bp होता आणि जर cDNA टेम्पलेट म्हणून वापरला गेला असेल तर तो 142bp होता.नंतर चाचणीच्या परिणामांमध्ये असे आढळून आले की cDNA चा काही भाग प्रत्यक्षात gDNA द्वारे दूषित झाला होता आणि हे देखील सिद्ध झाले की रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनच्या परिणामामध्ये कोणतीही समस्या नव्हती आणि ते PCR साठी टेम्पलेट म्हणून वापरले जाऊ शकते.अॅग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस थेट cDNA सह चालवणे निरुपयोगी आहे, आणि तो एक पसरलेला बँड आहे, जो खात्रीलायक नाही.

अंजीर 10 सीडीएनए शोध

qPCR अटींचे निर्धारणसामान्यत: किटच्या प्रोटोकॉलनुसार, प्रामुख्याने टीएम मूल्याच्या चरणात कोणतीही अडचण नसते.प्राइमर डिझाइन करताना काही प्राइमर्स चांगले डिझाइन केलेले नसल्यास, परिणामी tm मूल्य आणि सैद्धांतिक 60°C मध्ये मोठा फरक आढळल्यास, cDNA नमुने मिसळल्यानंतर, प्राइमरसह ग्रेडियंट PCR चालवा आणि TM मूल्य म्हणून बँडशिवाय तापमान सेट करणे टाळण्याचा प्रयत्न करा.

डेटा विश्लेषण

पारंपारिक सापेक्ष प्रतिदीप्ति परिमाणात्मक पीसीआर प्रक्रिया पद्धत मुळात 2 नुसार आहे-ΔΔCT.डेटा प्रोसेसिंग टेम्पलेट.

संबंधित उत्पादने:

रिअल टाइम पीसीआर सोपे^TM - ताकमान

रिअल टाइम पीसीआर सोपे^TM -SYBR ग्रीन I

RT Easy I (प्रथम स्ट्रँड सीडीएनए संश्लेषणासाठी मास्टर प्रीमिक्स)

RT Easy II (qPCR साठी प्रथम स्ट्रँड cDNA संश्लेषणासाठी मास्टर प्रीमिक्स)