प्रत्येकजण qRT-PCR प्रयोगाच्या तत्त्वाबद्दल बोलत आहे, प्राइमर डिझाइन, परिणाम व्याख्या, इ, परंतु मला वाटते की मी तुम्हाला qRT-PCR च्या प्रायोगिक ऑपरेशनची माहिती दिली पाहिजे.हे लहान आहे, परंतु ते परिणामांबद्दल आहे.
क्यूआरटी-पीसीआर करण्यापूर्वी, आम्हाला आमच्या स्वतःच्या आरएनए आणि ऑपरेशन पद्धतींची स्पष्ट माहिती असणे आवश्यक आहे.शेवटी, आमचे प्रयत्न केवळ सराव करण्याऐवजी परिणाम मिळवण्याच्या उद्देशाने आहेत.त्यामुळे qRT-PCR करण्याआधी, आम्हाला खालील मुद्दे निश्चित करावे लागतील (यापैकी काही फक्त SYBR ला लागू आहेत).
1 तुमची आरएनए खराब झालेली नाही याची तुम्हाला खात्री आहे का?
NanoDrop 2000 केवळ RNA ची एकाग्रता आणि शुद्धता शोधू शकते, परंतु RNA ची अखंडता शोधू शकत नाही.
RNA (RNA Intesity Number) मूल्य RNA ची अखंडता प्रतिबिंबित करू शकते, जे Agilent 2100 Bioanalyzer प्रणालीद्वारे शोधले जाते.
अंजीर. वेगवेगळ्या आरएनए नमुन्यांसाठी (युकेरियोट्स) आरआयएन मूल्यांचे योजनाबद्ध आकृती
तथापि, प्रयोगशाळांमध्ये सामान्यतः Agilent 2100 Bioanalyzer नसते.या प्रकरणात, आम्ही फॉर्मल्डिहाइड जेलद्वारे शोधू शकतो, परंतु एकूण आरएनएची आवश्यकता जास्त आहे, म्हणून सर्वात वेगवान पद्धत म्हणजे सामान्य जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस वापरणे.हे न्यूक्लिझ-मुक्त वातावरणात असणे आवश्यक आहे, म्हणून इलेक्ट्रोफोरेसीस टाकी, सोल बाटली, जेल ब्रॅकेट आणि कंगवा DEPC पाण्याने स्वच्छ धुवावे लागेल.अॅग्रोज देखील न्यूक्लिझ-मुक्त आहे (जोपर्यंत ते ताजे उघडलेले आहे), आणि लोडिंग बफर 1.2% जेलसह शक्य तितके ताजे उघडले पाहिजे.
लक्षात घ्या की जेल पूर्णपणे विरघळले पाहिजे, अन्यथा ते आकृतीमध्ये नमुना 9 मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, एकसंध पट्ट्या निर्माण करेल.जर व्होल्टेज खूप जास्त असेल किंवा जास्त काळ चालू असेल तर उष्णता निर्माण होईल आणि RNA ऱ्हास होईल, म्हणून व्होल्टेज आणि वेळ वाजवीपणे नियंत्रित केले पाहिजे.याव्यतिरिक्त, जेल रनिंग हे देखील निर्धारित करू शकते की नमुन्यामध्ये डीएनए अवशेष आहेत की नाही, आणि वितरीत विहिरीमध्ये मोठ्या प्रमाणात राखून ठेवलेले बँड आहेत की नाही हे देखील पहा.
आकृती.आरएनएचे जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस शोधणे
2 तुम्हाला तुमच्या cDNA च्या एकाग्रतेबद्दल खात्री आहे का?
प्रयोगशाळेतील मोठ्या बंधूंचा अनुभव असा आहे की प्रत्येक उलथापालथीद्वारे प्राप्त 20 ul प्रणालीचा cDNA थेट 20X पातळ केला जातो, तर पोस्ट-डॉक्टरल सिस्टर्स 10X पातळ केला जातो.मी सहसा परिस्थितीवर अवलंबून असतो.कारण प्रत्येक व्यक्तीने नमूद केलेल्या RNA ची गुणवत्ता वेगळी असते, उलट करण्याची पातळी देखील भिन्न असते आणि उलट तंत्रज्ञान स्थिर असू शकत नाही.
म्हणून प्रत्येक वेळी जेव्हा मला उलटा cDNA मिळेल, तेव्हा मी प्रथम ते सुमारे 3 वेळा पातळ करेन, आणि नंतर RT-PCR करण्यासाठी हाउसकीपिंग जनुक वापरेन, विशिष्ट एकाग्रता ओळखण्यासाठी, चक्रांची संख्या साधारणपणे 25 चक्रे असते, आणि नंतर अंतिम सौम्यता घटक निर्धारित करते.
3 तुमची खात्री आहे की तुमचे प्राइमर्स वापरण्यास सोपे आहेत?
ते qRT-PCR च्या वितळण्यातील वक्र पार करू शकते, परंतु तरीही यासाठी पैसे खर्च करावे लागतात.भरपूर पैसे नसलेल्या प्रयोगशाळांसाठी, जेव्हा त्यांना भरपूर प्राइमर्स मिळतात, तेव्हा ते एकल बँड आहे की नाही हे पाहण्यासाठी आणि प्राइमर्सची विशिष्टता ओळखण्यासाठी ते सामान्य RT-PCR वापरू शकतात.प्रयोगशाळेत पैशांची कमतरता नसल्यास, सर्व प्राइमर्सची विशिष्टता वितळण्याच्या वक्रातून एकदा ओळखली जाऊ शकते.
4 तुमची प्रायोगिक परिस्थिती योग्य असल्याची तुम्हाला खात्री आहे?
SYBR मजबूत प्रकाशापासून संरक्षित केले पाहिजे, म्हणून SYBR अभिकर्मक जोडताना ओव्हरहेड लाइट बंद करण्याचा प्रयत्न करा आणि ते पूर्ण करण्यासाठी फक्त मंद प्रकाश वापरणे आवश्यक आहे.
SYBR 4°C वर साठवा.वापरात असताना, फेस येऊ नये म्हणून चांगले मिसळण्यासाठी हळूवारपणे वर आणि खाली उलटा करा आणि जोरदारपणे भोवरा करू नका.
काही लहान बहिणींना नमुने मिसळण्याच्या भीतीने पीसीआर बोर्डवर गुण काढायला आवडतात, जे चुकीचे आहे.तुमच्या मार्करचा फ्लोरोसेंट सिग्नलच्या संकलनावर परिणाम होण्याची शक्यता असल्यामुळे, मी सामान्यत: कनिष्ठांना स्मृतीमध्ये मदत करण्यासाठी प्रायोगिक नोटबुक वापरण्याची शिफारस करतो, खाली दाखवल्याप्रमाणे.
आकृती.qRT-PCR नमुना लोडिंग आकृती
5 तुमची खात्री आहे की तुम्ही ते योग्य करत आहात?
हातमोजे घालण्याची खात्री करा, हातमोजे घाला, हातमोजे घाला आणि महत्त्वाच्या गोष्टी तीन वेळा सांगा.
SYBR चे प्रकाशात होणारे प्रदर्शन कमी करण्यासाठी, मला व्यक्तिशः प्रथम टेम्पलेट जोडणे आवडते, खाली दिलेल्या चित्रात दाखवल्याप्रमाणे.अनुभवानुसार, थोड्या प्रमाणात टेम्पलेट जोडल्याने सॅम्पलिंग त्रुटी होण्याची शक्यता आहे.म्हणून, थोड्या प्रमाणात टेम्पलेट जोडल्यामुळे होणारी त्रुटी कमी करण्यासाठी, मी सहसा नमुना पुन्हा दुप्पट करतो आणि H2O2 जोडलेले प्रमाण कमी करण्यासाठी नमुना जोडताना दुप्पट करतो.
आकृती.क्यूआरटी-पीसीआर लोडिंगचे योजनाबद्ध आकृती
त्यानंतर qRT-PCR प्रणाली खालीलप्रमाणे कॉन्फिगर करा.
आकृती.qRT-PCR प्रणाली तयारी आकृती
टीप: कॉन्फिगरेशन प्रक्रिया बर्फावर करणे आवश्यक आहे.
नमुना जोडल्यानंतर, पारदर्शक सीलिंग फिल्म पेस्ट करा.आपल्या हातांनी पारदर्शक सीलिंग फिल्मच्या पृष्ठभागाला स्पर्श न करण्याचा प्रयत्न करा, फक्त फिल्मच्या दोन्ही बाजूंच्या जागेतून कार्य करा.कारण फिंगरप्रिंट्सचा फ्लोरोसेंट सिग्नलच्या संकलनावरही परिणाम होऊ शकतो.नंतर सॅम्पल भिंतीवर लटकवण्यापासून रोखण्यासाठी 10 सेकंद कमी वेगाने त्वरीत सेंट्रीफ्यूज करण्यासाठी सेंट्रीफ्यूज वापरा.
संबंधित उत्पादने:
पोस्ट वेळ: एप्रिल-28-2023
