COVID-19 हा गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनाव्हायरस प्रकार 2 मुळे होणारा संसर्गजन्य रोग आहे. जेव्हा एखाद्या व्यक्तीला संसर्ग होतो तेव्हा सर्वात सामान्य लक्षणांमध्ये ताप, खोकला आणि श्वास लागणे यांचा समावेश होतो.

चाचणीसाठी वापरलेले नमुने नासोफरींजियल स्वॅब्स किंवा ऑरोफरींजियल स्वॅबद्वारे गोळा केले जाऊ शकतात.

पीसीआर म्हणजे काय?

कोरोनाव्हायरस शोधण्याची मानक पद्धत म्हणजे पॉलिमरेझ चेन रिएक्शन, पीसीआर.ही पद्धत आण्विक जीवशास्त्रात मोठ्या प्रमाणावर वापरली जाते.हे लाखो ते अब्जावधी विशिष्ट डीएनए तुकड्यांची द्रुतपणे कॉपी करू शकते.

नवीन कोरोनाव्हायरसमध्ये खूप लांब सिंगल-स्ट्रँडेड RNA जीनोम आहे.PCR द्वारे हे विषाणू शोधण्यासाठी, RNA रेणूंना त्यांच्या पूरक DNA अनुक्रमांमध्ये रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसद्वारे रूपांतरित करणे आवश्यक आहे आणि नंतर नवीन संश्लेषित DNA मानक PCR प्रक्रियेद्वारे वाढविले जाऊ शकते, ज्याला सामान्यतः RT-PCR म्हणून ओळखले जाते.

RT-PCR प्रक्रिया

आरएनए काढणे

ही पद्धत करण्यासाठी, विषाणूजन्य आरएनए मुळात काढला पाहिजे.सोयीस्कर, जलद आणि प्रभावी पृथक्करणासाठी विविध प्रकारच्या आरएनए शुद्धीकरण किटचा वापर केला जाऊ शकतो.

व्यावसायिक किट वापरून व्हायरल आरएनए काढण्यासाठी, प्रथम नमुना मायक्रोसेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये जोडा आणि नंतर ते लिसिस बफरमध्ये मिसळा.हा बफर अत्यंत विकृत आहे आणि त्यात सामान्यतः फिनॉल आणि ग्वानिडाइन आयसोथियोसायनेट असतात.याव्यतिरिक्त, अखंड व्हायरल आरएनएचे अलगाव सुनिश्चित करण्यासाठी RNase इनहिबिटर सामान्यतः लिसिस बफरमध्ये उपस्थित असतात.

लिसिस बफर जोडल्यानंतर, मिक्सिंग ट्यूब नाडीद्वारे भोवरा आणि खोलीच्या तपमानावर उबवा.नंतर लाइसिस बफरद्वारे प्रदान केलेल्या अत्यंत विकृत परिस्थितीत विषाणू नष्ट केला जातो.

नमुना लिस्ड केल्यानंतर, शुद्धीकरण प्रक्रियेसाठी सेंट्रीफ्यूज ट्यूब वापरली जाते.नमुना सेंट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये लोड केला जातो आणि नंतर सेंट्रीफ्यूज केला जातो.

ही प्रक्रिया एक घन फेज काढण्याची पद्धत आहे ज्यामध्ये स्थिर टप्प्यात सिलिका जेल मॅट्रिक्स असते.

इष्टतम मीठ आणि pH परिस्थितीत, RNA रेणू सिलिका झिल्लीशी बांधले जातात.

त्याच वेळी, प्रथिने आणि इतर दूषित पदार्थ काढून टाकले जातात.

सेंट्रीफ्यूगेशननंतर, सेंट्रीफ्यूज ट्यूबला स्वच्छ संग्रह ट्यूबमध्ये ठेवा, फिल्टर टाकून द्या आणि नंतर वॉशिंग बफर घाला.

मेम्ब्रेनद्वारे वॉश बफरला सक्ती करण्यासाठी ट्यूब पुन्हा सेंट्रीफ्यूजमध्ये ठेवा.हे झिल्लीतील सर्व उरलेल्या अशुद्धी काढून टाकेल, फक्त RNA सिलिका जेलशी बांधील राहील.

नमुना धुतल्यानंतर, ट्यूबला स्वच्छ मायक्रोसेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये ठेवा आणि इल्यूशन बफर घाला.

नंतर पडद्याद्वारे इल्युशन बफरला सक्ती करण्यासाठी ते सेंट्रीफ्यूज केले जाते.इल्युशन बफर स्पिन कॉलममधून व्हायरल आरएनए काढून टाकते आणि प्रथिने, इनहिबिटर आणि इतर दूषित पदार्थांपासून मुक्त आरएनए मिळवते.

पायरी 2

मिश्रित एकाग्रता

व्हायरल आरएनए काढल्यानंतर, पुढील पायरी म्हणजे पीसीआर प्रवर्धनासाठी प्रतिक्रिया मिश्रण तयार करणे.या चरणात, एकाग्रता वापरली जाते.हे केंद्रित द्रावण प्रीमिक्स, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस, न्यूक्लियोटाइड्स, फॉरवर्ड प्राइमर, रिव्हर्स प्राइमर, टाकमन प्रोब आणि डीएनए पॉलिमरेझ यांचा समावेश असलेले प्रिमिक्स केलेले केंद्रित समाधान आहे.

शेवटी, हे अभिक्रिया मिश्रण पूर्ण करण्यासाठी, RNA टेम्पलेट जोडला जातो.नाडी भोवरा करून नळ्या मिसळल्या जातात आणि नंतर प्रतिक्रिया मिश्रण पीसीआर प्लेटमध्ये लोड केले जाते.पीसीआर प्लेटमध्ये सामान्यतः 96 विहिरी असतात आणि एकाच वेळी अनेक नमुन्यांचे विश्लेषण करू शकतात.

पायरी 3

पीसीआर प्रवर्धन

पुढे, प्लेट पीसीआर मशीनमध्ये ठेवा, जे मूलत: थर्मल सायकलर आहे.

रिअल-टाइम RT-PCR चा वापर RdrRP जनुक, E जनुक आणि N जनुकातील लक्ष्य क्रम वाढवून 2019 कादंबरी कोरोनाव्हायरस शोधण्यासाठी केला जातो.लक्ष्य जनुकाची निवड प्राइमर आणि प्रोबच्या क्रमावर अवलंबून असते.

RT-PCR ची पहिली पायरी म्हणजे रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन.पूरक डीएनएचा पहिला स्ट्रँड संश्लेषित केला जातो, जो पीसीआर रिव्हर्स प्राइमरद्वारे सुरू केला जातो, जो व्हायरल आरएनए जीनोमच्या पूरक भागाशी जोडतो.नंतर रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस, व्हायरल RNA ला पूरक DNA संश्लेषित करण्यासाठी प्राइमरच्या 3′एंडला DNA nucleotides जोडते.या पायरीचे तापमान आणि कालावधी प्राइमर, टार्गेट आरएनए आणि वापरलेल्या रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसवर अवलंबून असतात.

पुढे, प्रारंभिक विकृतीकरण चरण लागू केले जाते, ज्यामुळे RNA-DNA संकराचे विकृतीकरण होते.डीएनए पॉलिमरेज सक्रिय करण्यासाठी ही पायरी आवश्यक आहे.त्याच वेळी, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस निष्क्रिय आहे.

पीसीआरमध्ये थर्मल चक्रांची मालिका असते.प्रत्येक चक्रामध्ये विकृतीकरण, एनीलिंग आणि विस्तार चरणांचा समावेश असतो.

विकृतीकरण पायरीमध्ये प्रतिक्रिया कक्ष 95 अंश सेल्सिअस पर्यंत गरम करणे आणि दुहेरी-असरलेल्या DNA टेम्पलेटच्या विकृतीकरणासाठी वापरणे समाविष्ट आहे.

पुढील चरणात, प्रतिक्रियेचे तापमान 58 अंश सेल्सिअसपर्यंत कमी केले जाते, ज्यामुळे फॉरवर्ड प्राइमरला त्याच्या सिंगल-स्ट्रँडेड डीएनए टेम्प्लेटच्या पूरक भागाशी जोडणे शक्य होते.अॅनिलिंग तापमान थेट प्राइमरची लांबी आणि रचना यावर अवलंबून असते.

विस्तार चरणात, DNA पॉलिमरेज नवीन DNA स्ट्रँडचे संश्लेषण करते जे DNA टेम्पलेट स्ट्रँडला पूरक आहे.अभिक्रिया मिश्रणातून 5′ते 3′दिशेमध्ये टेम्पलेटला पूरक मुक्त केंद्रक जोडून.या पायरीचे तापमान वापरलेल्या डीएनए पॉलिमरेजवर अवलंबून असते.

पहिल्या चक्रानंतर, दुहेरी अडकलेले डीएनए लक्ष्य प्राप्त केले जाते.

त्यानंतर, दुसरे चक्र प्रविष्ट करा.डबल-स्ट्रँडेड डीएनए दोन सिंगल-स्ट्रँड डीएनए रेणू तयार करण्यासाठी विकृत केले जाते.

पुढील चरणात, प्रतिक्रियेचे तापमान कमी केले जाते, प्रत्येक सिंगल-स्ट्रँडेड डीएनए टेम्पलेटवर प्राइमर्स जोडले जातात आणि टाक-मॅन प्रोब लक्ष्यित डीएनएच्या पूरक भागाशी जोडले जाते.

TaqMan प्रोबमध्ये ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्रोबच्या 5′एंडशी सहसंयोजकपणे जोडलेले फ्लोरोफोर असते.जेव्हा सायकलरच्या प्रकाश स्रोताने उत्तेजित होते तेव्हा फ्लोरोफोर फ्लोरोसेन्स उत्सर्जित करते.याव्यतिरिक्त, प्रोब 3′एंडला क्वेंचरने बनलेला आहे.क्वेन्चरच्या रिपोर्टर जीनची निकटता फ्लोरोसेन्स शोधण्यास प्रतिबंध करते.

विस्तार चरणात, डीएनए पॉलिमरेझ नवीन स्ट्रँडचे संश्लेषण करते.जेव्हा पॉलिमरेझ TaqMan प्रोबपर्यंत पोहोचते, तेव्हा त्याची अंतर्जात 5′न्यूक्लिझ क्रिया प्रोबला क्लीव्ह करते, डाई क्वेन्चरपासून वेगळे करते.

पीसीआरच्या प्रत्येक चक्रासह, अधिक रंगाचे रेणू सोडले जातात, परिणामी संश्लेषित एम्प्लिकॉनच्या संख्येच्या प्रमाणात फ्लोरोसेन्स तीव्रतेत वाढ होते.

ही पद्धत नमुन्यामध्ये उपस्थित असलेल्या दिलेल्या अनुक्रमांच्या संख्येचा अंदाज लावू देते.दुहेरी अडकलेल्या DNA तुकड्यांची संख्या प्रत्येक चक्रात दुप्पट होते.म्हणून, पीसीआरचा वापर अगदी लहान नमुन्यांचे विश्लेषण करण्यासाठी केला जाऊ शकतो.

फ्लोरोसेंट सिग्नल मोजण्यासाठी, टंगस्टन हॅलोजन दिवा, उत्तेजना फिल्टर, परावर्तक, लेन्स, उत्सर्जन फिल्टर आणि चार्ज कपल्ड डिव्हाइस-वापर CCD कॅमेरा.

पायरी 4 शोधा

फ्लोरोसेंट सिग्नल मोजण्यासाठी, टंगस्टन हॅलोजन दिवा, उत्तेजना फिल्टर, परावर्तक, लेन्स, उत्सर्जन फिल्टर आणि चार्ज कपल्ड डिव्हाइस-वापर CCD कॅमेरा.

दिव्यातील फिल्टर केलेला प्रकाश रिफ्लेक्टरद्वारे परावर्तित होतो, कंडेनसर लेन्समधून जातो आणि प्रत्येक छिद्राच्या मध्यभागी केंद्रित असतो.नंतर छिद्रातून उत्सर्जित होणारा फ्लूरोसेन्स आरशातून परावर्तित होतो, उत्सर्जन फिल्टरमधून जातो आणि CCD कॅमेराद्वारे शोधला जातो.प्रत्येक पीसीआर चक्रामध्ये, स्वयं-उत्तेजित फ्लोरोफोर प्रकाश सीसीडीद्वारे शोधला जाऊ शकतो.

हे कॅप्चर केलेल्या प्रकाशाचे डिजिटल डेटामध्ये रूपांतर करते.या पद्धतीला रिअल-टाइम पीसीआर म्हणतात, आणि ते पीसीआर प्रतिक्रियेच्या प्रगतीचे वास्तविक-वेळ निरीक्षण करण्यास अनुमती देते.