पीसीआर (पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शन) हे इन-व्हिट्रो डीएनए प्रवर्धन तंत्रज्ञानांपैकी एक आहे, ज्याचा इतिहास 30 वर्षांहून अधिक आहे.

1983 मध्ये सेटस, यूएसएच्या कॅरी मुलिस यांनी पीसीआर तंत्रज्ञानाची सुरुवात केली. मुलिसने 1985 मध्ये पीसीआर पेटंटसाठी अर्ज केला आणि त्याच वर्षी विज्ञानावरील पहिला पीसीआर शैक्षणिक पेपर प्रकाशित केला.मुलिस यांना त्यांच्या कार्यासाठी 1993 मध्ये रसायनशास्त्रातील नोबेल पारितोषिक देण्यात आले.

पीसीआरची मूलभूत तत्त्वे

पीसीआर लक्ष्यित डीएनए तुकड्यांना दहा लाखांहून अधिक वेळा वाढवू शकतो.टेम्प्लेट म्हणून पॅरेंट स्ट्रँड डीएनए आणि विस्तारासाठी प्रारंभिक बिंदू म्हणून विशिष्ट प्राइमर वापरणे हे तत्त्व डीएनए पॉलिमरेझच्या उत्प्रेरकाखाली आहे.हे विट्रोमध्ये विकृतीकरण, अॅनिलिंग आणि विस्तार यांसारख्या चरणांद्वारे प्रतिरूपित केले जाते.मुलगी स्ट्रँड डीएनएची प्रक्रिया पालक स्ट्रँड टेम्पलेट डीएनएला पूरक आहे.

मानक पीसीआर प्रक्रिया तीन चरणांमध्ये विभागली आहे:

1.डिनेच्युरेशन: डीएनए डबल स्ट्रँड वेगळे करण्यासाठी उच्च तापमान वापरा.DNA दुहेरी पट्ट्यांमधील हायड्रोजन बंध उच्च तापमानात (93-98℃) तुटतो.

2.अॅनिलिंग: डबल-स्ट्रँडेड डीएनए विभक्त झाल्यानंतर, तापमान कमी करा जेणेकरून प्राइमर सिंगल-स्ट्रँडेड डीएनएला बांधू शकेल.

3.विस्तार: तापमान कमी केल्यावर डीएनए पॉलिमरेझ बांधलेल्या प्राइमर्समधून डीएनए स्ट्रँडसह पूरक स्ट्रँड्सचे संश्लेषण करण्यास सुरवात करते.जेव्हा विस्तार पूर्ण होतो, तेव्हा एक चक्र पूर्ण होते आणि DNA तुकड्यांची संख्या दुप्पट होते

या तीन पायऱ्या 25-35 वेळा परस्पर केल्यास, DNA तुकड्यांची संख्या वेगाने वाढेल.

PCR ची कल्पकता अशी आहे की भिन्न प्राइमर्स वेगवेगळ्या लक्ष्य जनुकांसाठी डिझाइन केले जाऊ शकतात, ज्यामुळे लक्ष्य जनुकांचे तुकडे कमी कालावधीत वाढवता येतात.

आतापर्यंत, पीसीआरची तीन श्रेणींमध्ये विभागणी केली जाऊ शकते, म्हणजे सामान्य पीसीआर, फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक पीसीआर आणि डिजिटल पीसीआर.

सामान्य पीसीआरची पहिली पिढी

लक्ष्य जनुक वाढवण्यासाठी एक सामान्य पीसीआर प्रवर्धक साधन वापरा, आणि नंतर उत्पादन शोधण्यासाठी अॅग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस वापरा, केवळ गुणात्मक विश्लेषण केले जाऊ शकते.

पहिल्या पिढीच्या पीसीआरचे मुख्य तोटे:

1.नॉन-विशिष्ट प्रवर्धन आणि चुकीच्या सकारात्मक परिणामांना प्रवण.

2. शोधण्यात बराच वेळ लागतो आणि ऑपरेशन अवघड आहे.

3.केवळ गुणात्मक चाचणी केली जाऊ शकते

दुसऱ्या पिढीचा रिअल-टाइम पीसीआर

रिअल-टाइम पीसीआर, ज्याला क्यूपीसीआर म्हणूनही ओळखले जाते, फ्लोरोसेंट प्रोबचा वापर करते जे प्रतिक्रिया प्रणालीची प्रगती दर्शवू शकतात आणि फ्लोरोसेंट सिग्नलच्या संचयाद्वारे वाढीव उत्पादनांच्या संचयनाचे निरीक्षण करते आणि फ्लूरोसेन्स वक्र द्वारे परिणामांचे परीक्षण करते.हे Cq मूल्य आणि मानक वक्र च्या मदतीने परिमाण केले जाऊ शकते.

कारण qPCR तंत्रज्ञान बंद प्रणालीमध्ये चालते, दूषित होण्याची शक्यता कमी होते, आणि फ्लूरोसेन्स सिग्नलचे परिमाणात्मक तपासणीसाठी परीक्षण केले जाऊ शकते, म्हणून ते क्लिनिकल प्रॅक्टिसमध्ये सर्वात जास्त वापरले जाते आणि ते PCR मधील प्रबळ तंत्रज्ञान बनले आहे.

रिअल-टाइम फ्लोरोसेंट परिमाणवाचक पीसीआरमध्ये वापरलेले फ्लोरोसेंट पदार्थ यामध्ये विभागले जाऊ शकतात: TaqMan फ्लोरोसेंट प्रोब, आण्विक बीकन्स आणि फ्लोरोसेंट डाई.

1) TaqMan फ्लोरोसेंट प्रोब:

पीसीआर प्रवर्धनादरम्यान, प्राइमरची जोडी जोडताना एक विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोब जोडला जातो.प्रोब ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड आहे आणि दोन्ही टोकांना रिपोर्टर फ्लोरोसेंट ग्रुप आणि क्वेन्चर फ्लोरोसेंट ग्रुपने लेबल केले आहे.

जेव्हा प्रोब अखंड असतो, तेव्हा रिपोर्टर ग्रुपद्वारे उत्सर्जित होणारा फ्लोरोसेंट सिग्नल शमन गटाद्वारे शोषला जातो;PCR प्रवर्धनादरम्यान, Taq एंझाइमची 5′-3′ exonuclease गतिविधी प्रोबला क्लीव्ह करते आणि खराब करते, ज्यामुळे रिपोर्टर फ्लोरोसेंट ग्रुप आणि क्वेंचर फ्लूरोसंट ग्रुप वेगळे केले जातात, जेणेकरून फ्लूरोसेन्स मॉनिटरींग सिस्टम फ्लूरोसेन्स सिग्नल प्राप्त करू शकते, म्हणजेच, प्रत्येक वेळी एक एमओएलए फॉर्म आणि डीएनए फ्लूरोसेंट आहे. फ्लोरोसेन्स सिग्नलचे संचय पीसीआर उत्पादनाच्या निर्मितीसह पूर्णपणे सिंक्रोनाइझ केले जाते.

2) SYBR फ्लोरोसेंट डाई:

पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणालीमध्ये, एसवायबीआर फ्लोरोसेंट डाईचा अतिरिक्त समावेश केला जातो.SYBR फ्लोरोसेंट डाई विशेषत: DNA डबल-स्ट्रँडमध्ये समाविष्ट केल्यानंतर, ते फ्लोरोसेंट सिग्नल उत्सर्जित करते.SYBR डाई रेणू जो साखळीमध्ये समाविष्ट केलेला नाही तो कोणताही फ्लोरोसेंट सिग्नल सोडणार नाही, ज्यामुळे फ्लोरोसेंट सिग्नलची खात्री होईल PCR उत्पादनांमध्ये वाढ PCR उत्पादनांच्या वाढीसह पूर्णपणे समक्रमित केली जाते.SYBR फक्त दुहेरी-असरलेल्या DNA ला बांधते, त्यामुळे PCR प्रतिक्रिया विशिष्ट आहे की नाही हे निर्धारित करण्यासाठी वितळण्याचा वक्र वापरला जाऊ शकतो.

3) आण्विक बीकन:

हे एक स्टेम-लूप डबल-लेबल केलेले ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्रोब आहे जे 5 आणि 3 टोकांना सुमारे 8 बेसची हेअरपिन रचना बनवते.दोन्ही टोकांवरील न्यूक्लिक अॅसिड अनुक्रम पूरकपणे जोडलेले असतात, ज्यामुळे फ्लोरोसेंट गट आणि शमन गट घट्ट होतो.बंद करा, फ्लूरोसेन्स तयार होणार नाही.

पीसीआर उत्पादन तयार झाल्यानंतर, अॅनिलिंग प्रक्रियेदरम्यान, आण्विक बीकनचा मधला भाग एका विशिष्ट डीएनए अनुक्रमाने जोडला जातो आणि फ्लूरोसेन्ट जनुक क्वेन्चर जनुकापासून वेगळे केले जाते ज्यामुळे फ्लोरोसेन्स तयार होतो.

दुसऱ्या पिढीच्या पीसीआरचे मुख्य तोटे:

संवेदनशीलता अजूनही कमी आहे, आणि कमी-कॉपी नमुने शोधणे चुकीचे आहे.

पार्श्वभूमी मूल्याचा प्रभाव आहे आणि परिणाम हस्तक्षेपास संवेदनाक्षम आहे.

जेव्हा प्रतिक्रिया प्रणालीमध्ये पीसीआर इनहिबिटर असतात, तेव्हा शोध परिणाम हस्तक्षेपास संवेदनाक्षम असतात.

तिसरी पिढी डिजिटल पीसीआर

डिजिटल पीसीआर (डिजिटलपीसीआर, डीपीसीआर, डीआयजी-पीसीआर) अंतिम-बिंदू शोधाद्वारे लक्ष्य क्रमाच्या कॉपी क्रमांकाची गणना करते आणि अंतर्गत नियंत्रणे आणि मानक वक्र न वापरता अचूक परिपूर्ण परिमाणवाचक ओळख करू शकते.

डिजिटल PCR एंड-पॉइंट डिटेक्शन वापरते आणि Ct मूल्य (सायकल थ्रेशोल्ड) वर अवलंबून नसते, त्यामुळे डिजिटल PCR प्रतिक्रिया प्रवर्धन कार्यक्षमतेमुळे कमी प्रभावित होते आणि उच्च अचूकता आणि पुनरुत्पादनक्षमतेसह PCR प्रतिक्रिया अवरोधकांना सहनशीलता सुधारली जाते.

उच्च संवेदनशीलता आणि उच्च अचूकतेच्या वैशिष्ट्यांमुळे, PCR प्रतिक्रिया अवरोधकांकडून यात सहजासहजी हस्तक्षेप होत नाही आणि ते प्रमाणित उत्पादनांशिवाय खरे परिपूर्ण परिमाण प्राप्त करू शकते, जे संशोधन आणि अनुप्रयोगाचे हॉटस्पॉट बनले आहे.

प्रतिक्रिया युनिटच्या विविध स्वरूपांनुसार, ते तीन मुख्य प्रकारांमध्ये विभागले जाऊ शकते: मायक्रोफ्लुइडिक, चिप आणि ड्रॉपलेट सिस्टम.

1) मायक्रोफ्लुइडिक डिजिटल पीसीआर, एमडीपीसीआर:

मायक्रोफ्लुइडिक तंत्रज्ञानावर आधारित, डीएनए टेम्पलेट वेगळे केले जाते.मायक्रोफ्लुइडिक तंत्रज्ञान नमुना नॅनो-अपग्रेडिंग किंवा लहान थेंबांची निर्मिती ओळखू शकते, परंतु थेंबांना विशेष शोषण पद्धतीची आवश्यकता असते आणि नंतर पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणालीसह एकत्र केले जाते.mdPCR हळूहळू बदलून इतर पद्धतींचा अवलंब केला जातो.

२) ड्रॉपलेट-आधारित डिजिटल पीसीआर, डीडीपीसीआर:

नमुन्यावर थेंबांमध्ये प्रक्रिया करण्यासाठी वॉटर-इन-ऑइल ड्रॉपलेट निर्मिती तंत्रज्ञान वापरा आणि न्यूक्लिक अॅसिड रेणू असलेली प्रतिक्रिया प्रणाली हजारो नॅनोस्केल थेंबांमध्ये विभाजित करा, ज्यापैकी प्रत्येकामध्ये शोधण्यासाठी न्यूक्लिक अॅसिड लक्ष्य रेणू नसतात किंवा चाचणी करण्यासाठी एक ते अनेक न्यूक्लिक अॅसिड लक्ष्य रेणू असतात.

3) चिप-आधारित डिजिटल पीसीआर, सीडीपीसीआर:

सिलिकॉन वेफर्स किंवा क्वार्ट्ज ग्लासवर अनेक मायक्रोट्यूब्स आणि मायक्रोकॅव्हिटी कोरण्यासाठी इंटिग्रेटेड फ्लुइड पाथवे तंत्रज्ञान वापरा आणि निरनिराळ्या कंट्रोल व्हॉल्व्हद्वारे द्रावणाचा प्रवाह नियंत्रित करा, आणि अचूक परिमाण साध्य करण्यासाठी डिजिटल पीसीआर रिअॅक्शनसाठी प्रतिक्रियेच्या विहिरींमध्ये नमुना द्रव समान आकाराच्या नॅनोमीटरमध्ये विभाजित करा.

तिसऱ्या पिढीच्या पीसीआरचे मुख्य तोटे:

उपकरणे आणि अभिकर्मक महाग आहेत.

टेम्पलेट गुणवत्ता आवश्यकता उच्च आहेत.जर टेम्प्लेटचे प्रमाण मायक्रोसिस्टमच्या प्रमाणापेक्षा जास्त असेल, तर ते मोजणे अशक्य होईल आणि जर ते खूप लहान असेल तर, परिमाण अचूकता कमी होईल.

गैर-विशिष्ट प्रवर्धन असताना खोटे सकारात्मक देखील व्युत्पन्न केले जाऊ शकतात.