RT-qPCR हा आण्विक जीवशास्त्राचा मूलभूत प्रयोग आहे आणि प्रत्येकाने त्याच्याशी परिचित असणे आवश्यक आहे.यामध्ये प्रामुख्याने तीन पायऱ्यांचा समावेश होतो: RNA काढणे, cDNA मध्ये उलट प्रतिलेखन आणि रिअल-टाइम फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक PCR.हे मदत करत नाही, काय चालले आहे?सह समस्या असण्याची शक्यता आहेउलट प्रतिलेखन प्रयोग!जरी असे दिसते की रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रयोगासाठी फक्त RNA, dNTP, प्राइमर्स आणि जोडणे आवश्यक आहेउलट ट्रान्सक्रिप्टेससेंट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये आणि चांगले मिसळा, परंतु वास्तविक ऑपरेशन प्रक्रियेत, अजूनही बरेच तपशील आहेत ज्याकडे लक्ष देणे आवश्यक आहे.चला त्याबद्दल जाणून घेऊया!

आरएनएची गुणवत्ता कशी ठरवायची?
सीडीएनए मिळविण्यासाठी, आरएनएची गुणवत्ता गंभीर आहे!आरएनए गुणवत्ता प्रामुख्याने दोन पैलूंवरून शोधली जाऊ शकते:
(1) आरएनए अखंडता:Agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस द्वारे RNA अखंडता सत्यापित केली जाऊ शकते. युकेरियोट्सचे उदाहरण घेतल्यास, संपूर्ण एकूण आरएनएमध्ये तीन स्पष्ट पट्ट्या आहेत, मोठ्या ते लहान आण्विक वजन 28S, 18S आणि 5S आहेत आणि 28S 18S पेक्षा दुप्पट तेजस्वी आहे;जर तीन बँड दिसू शकतील, परंतु बँड प्रकार अस्पष्ट असेल किंवा प्रसार म्हणजे आरएनए अंशतः खराब झाला असेल.यावेळी, कृपया रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन रिअॅक्शन ताबडतोब करा आणि टेम्पलेट इनपुट योग्यरित्या वाढवा;जर फक्त लहान आण्विक वजन असलेला बँड किंवा कोणताही बँड दिसत नसेल, तर आरएनए पूर्णपणे खराब झाला आहे आणि तो पुन्हा काढला जाणे आवश्यक आहे.Agilent 2100 शिखर आकृती आणि RIN मूल्यासह RNA ची अखंडता दर्शवते.जर न्यूक्लिक अॅसिड अखंड असेल, तर इलेक्ट्रोफेरोग्रामची बेसलाइन सपाट असते;जर न्यूक्लिक अॅसिड गंभीरपणे खराब झाले असेल, तर बेसलाइन असमान असेल आणि अधिक ऱ्हासाची शिखरे दिसतात;RIN चे मूल्य RNA ची अखंडता दर्शवते, 0-10 च्या मर्यादेत, मूल्य जितके मोठे असेल तितकी RNA ची गुणवत्ता चांगली.बरं, पूर्णतेची डिग्री जितकी जास्त असेल.
(२) आरएनएची शुद्धता:OD260/280 चे प्रमाण यूव्ही स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रीद्वारे शोधले जाऊ शकते.OD260/280 चे प्रमाण 1.9 आणि 2.1 च्या दरम्यान असल्यास, शुद्धता खूप चांगली आहे.
अवशिष्ट जीनोमिक डीएनए चुकीच्या परिमाणवाचक परिणामांना कारणीभूत ठरू शकतात
जेव्हा आरएनए काढला जातो, तेव्हा आम्हाला मिळणारा आरएनए जीनोमिक डीएनए (जीडीएनए) मध्ये मिसळला जाऊ शकतो जो साफ केला गेला नाही.त्यामुळे, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन नंतरचे सीडीएनए देखील मिसळले जाईलgDNA.डाउनस्ट्रीम दरम्यानqPCRप्रतिक्रिया,cDNAआणि gDNA एकाच वेळी वाढवले ​​जाऊ शकते, परिणामी एक तुलनेने लहान CT मूल्य आहे, त्यामुळे परिणाम पक्षपाती असू शकतात.
मग या परिस्थितीत आपण काय करावे?फोरजीनसुचवते:
(१) उलटलेल्या आरएनएवर जीनोमची स्वच्छता करा, जी आरएनए काढताना स्तंभ काढण्याद्वारे काढली जाऊ शकते;
(2) काढलेल्या RNA वर DNase सह उपचार कराI , परंतु EDTA सह समाप्त करा;
रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन अभिकर्मकांचेजीनोम क्लिअरिंग मॉड्यूलसह;

रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनसाठी प्राइमर्स कसे निवडायचे?
रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्राइमर्स रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन रिअॅक्शनच्या परिणामावर देखील परिणाम करतात.प्रयोगाच्या विशिष्ट परिस्थितीनुसार रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनसाठी तुम्ही यादृच्छिक प्राइमर्स, ऑलिगो डीटी किंवा जीन-विशिष्ट प्राइमर्स निवडू शकता:
(1) विशिष्ट प्रतिलिपी: जनुक-विशिष्ट प्राइमर्सची शिफारस केली जाते;
(2) लांब तुकड्यांचे प्रतिलेख: ऑलिगो डीटी/जीन-विशिष्ट प्राइमर्सची शिफारस केली जाते;
(3) लांब-सेगमेंट प्रतिलेखांचे अंतर्गत तुकडे: जीन-विशिष्ट प्राइमर्स/ यादृच्छिक प्राइमर्स/यादृच्छिक प्राइमर्स + ऑलिगो डीटी.त्यानंतरचा qPCR प्रयोग केल्यास, Oligo dT एकट्याने वापरला जाऊ शकत नाही, कारण Oligo dT एकट्याने वापरल्याने 3′ एंड बायस होऊ शकतो, ज्यामुळे चुकीचे qPCR प्रयोग परिणाम होऊ शकतात;
(4) miRNA: स्टेम-लूप प्राइमर्स किंवा टेलिंग प्राइमर्स वापरता येतात.

रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन उत्पादन cDNA प्रमाणीकरणासाठी किती वेळा पातळ केले पाहिजे?
रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन उत्पादनाचे सीडीएनए प्राप्त केल्यानंतर, क्यूपीसीआर प्रयोगांसाठी सीडीएनए किती वेळा पातळ केले जावे हे खूप महत्वाचे आहे.सीडीएनए एकाग्रता खूप जास्त किंवा खूप कमी असल्यास, प्रवर्धन कार्यक्षमतेवर परिणाम होऊ शकतो.सीडीएनए एकाग्रता मोजली जाऊ शकते आणि ते कसे केले पाहिजे?
(1) रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन उत्पादनाची cDNA एकाग्रता मोजली जाऊ शकत नाही, कारण cDNA उत्पादनाव्यतिरिक्त, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन उत्पादनामध्ये रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन रेसिड्यूअल बफर, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस, प्राइमर्स इ. देखील असतात, जे एकाग्रता मापन परिणामांमध्ये व्यत्यय आणतील आणि त्यामुळे OD260/280, OD260/280 आणि abDNA, OD236, OD236, OD, 280, 280, 100,000,000,000,000,000,000,000% क्षेत्रयावेळी काही मित्र म्हणतील, मी शुद्धीकरणानंतर एकाग्रता मोजेन;येथे, फोरजीन हे स्मरण करून देऊ इच्छितो की सीडीएनए शुद्ध करण्याची शिफारस केलेली नाही, कारण रिव्हर्सलद्वारे प्राप्त सीडीएनएची लांबी वेगळी असते आणि शुद्धीकरणामध्ये लहान सीडीएनए नष्ट होईल.
(२) मग काय करावे?qPCR प्रयोगापूर्वी, पूर्व-प्रयोगाद्वारे सीडीएनएचा सौम्यता ग्रेडियंट निर्धारित केला जाऊ शकतो.उदाहरणार्थ: qPCR प्रयोगांसाठी cDNA स्टॉक सोल्यूशन, 10-fold dilution आणि 100-fold dilution चा टेम्प्लेट म्हणून वापर करा आणि 18-28 च्या रेंजमध्ये CT व्हॅल्यू असलेले डायल्युशन फॅक्टर निवडा.

miRNA चे उलटे लिप्यंतरण कसे करावे?
miRNA हा एकल-अटकलेला लहान रेणू RNA आहे ज्याचा आकार सुमारे 22 nt आहे जो प्रथिनांना कोड देत नाही.त्याच्या लहान लांबीमुळे, पारंपारिक qPCR पद्धतीमुळे त्याचे थेट परिमाण करणे कठीण आहे, म्हणून अनेकदा miRNA वाढवणे आवश्यक असते;miRNA साठी सामान्यतः वापरल्या जाणार्‍या रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन पद्धतींमध्ये स्टेम-लूप पद्धत आणि टेलिंग पद्धत समाविष्ट आहे.
स्टेम-लूप पद्धत म्हणजे स्टेम-लूप प्राइमर्स जोडून miRNA वाढवणे.या शोध पद्धतीमध्ये उच्च संवेदनशीलता आणि विशिष्टता आहे, परंतु शोध थ्रूपुट कमी आहे.एक रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन फक्त एक miRNA आणि अंतर्गत संदर्भ शोधू शकतो;शेपूट जोडण्याची पद्धत दोन बनलेली आहे ती पॉलिए पॉलिमरेझ आणि रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस या दोन एन्झाइमच्या संयुक्त क्रियेद्वारे पूर्ण होते.पॉलीए पॉलिमरेझ त्याची लांबी वाढवण्यासाठी एमआयआरएनएमध्ये पॉलीए शेपटी जोडण्यासाठी जबाबदार आहे आणि रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन रिअॅक्शन करते.या पद्धतीमध्ये उच्च शोध थ्रूपुट आहे आणि एका उलट प्रतिलेखनामध्ये एकाधिक miRNA आणि अंतर्गत संदर्भ शोधू शकतात, परंतु स्टेम-लूप पद्धतीमध्ये संवेदनशीलता आणि विशिष्टता कमी आहे.