Ct मूल्य हे फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक PCR चे सर्वात महत्वाचे परिणाम सादरीकरण स्वरूप आहे.हे जनुक अभिव्यक्ती फरक किंवा जनुक कॉपी क्रमांक मोजण्यासाठी वापरले जाते.तर फ्लूरोसेन्स क्वांटिफिकेशनचे Ct मूल्य वाजवी मानले जाते?Ct मूल्याची प्रभावी श्रेणी कशी सुनिश्चित करावी?

सीटी व्हॅल्यू म्हणजे काय?
qPCR प्रवर्धन प्रक्रियेदरम्यान, प्रवर्धित उत्पादनाचा फ्लूरोसेन्स सिग्नल सेट फ्लूरोसेन्स थ्रेशोल्डपर्यंत पोहोचल्यावर प्रवर्धन चक्रांची संबंधित संख्या (सायकल थ्रेशोल्ड).C म्हणजे सायकल आणि T म्हणजे थ्रेशोल्ड.सोप्या भाषेत सांगायचे तर, Ct मूल्य हे qPCR मधील उत्पादनाच्या विशिष्ट प्रमाणात प्रारंभिक टेम्प्लेट अॅम्प्लिफिकेशनपर्यंत पोहोचते तेव्हा संबंधित चक्रांची संख्या असते.तथाकथित "उत्पादनाची ठराविक रक्कम" नंतर पुढे स्पष्ट केली जाईल.

Ct मूल्य काय करते?

1. घातांकीय प्रवर्धन, टेम्पलेट रक्कम आणि Ct मूल्य यांच्यातील संबंध
तद्वतच, qPCR मधील जीन्स विशिष्ट संख्येच्या चक्रांनंतर घातांकीय प्रवर्धनाद्वारे जमा होतात.प्रवर्धन चक्रांची संख्या आणि उत्पादनांची रक्कम यांच्यातील संबंध आहे: प्रवर्धित उत्पादन रक्कम = प्रारंभिक टेम्पलेट रक्कम × (1+En) चक्र संख्या.तथापि, qPCR प्रतिक्रिया नेहमीच आदर्श परिस्थितीत नसते.जेव्हा प्रवर्धित उत्पादनाची रक्कम "विशिष्ट उत्पादन रकमेपर्यंत" पोहोचते, तेव्हा यावेळी चक्रांची संख्या Ct मूल्य असते आणि ती घातांकीय प्रवर्धन कालावधीत असते.Ct मूल्य आणि प्रारंभिक टेम्पलेटचे प्रमाण यांच्यातील संबंध: टेम्पलेटचे Ct मूल्य आणि टेम्पलेटच्या प्रारंभीच्या कॉपी क्रमांकाच्या लॉगरिथममध्ये एक रेषीय संबंध आहे.प्रारंभिक टेम्पलेट एकाग्रता जितकी जास्त असेल तितके Ct मूल्य लहान असेल;प्रारंभिक टेम्पलेट एकाग्रता जितकी कमी असेल तितके Ct मूल्य मोठे असेल.

2.प्रवर्धन वक्र, फ्लूरोसेन्स थ्रेशोल्ड आणि विशिष्ट PCR उत्पादन रक्कम
qPCR प्रवर्धन उत्पादनाची रक्कम थेट फ्लोरोसेंट सिग्नलच्या रूपात सादर केली जाते, म्हणजे, प्रवर्धन वक्र.पीसीआरच्या सुरुवातीच्या टप्प्यात, प्रवर्धन आदर्श परिस्थितीत आहे, चक्रांची संख्या लहान आहे, उत्पादनाचे संचय लहान आहे आणि फ्लोरोसेन्सची पातळी फ्लोरोसेन्स पार्श्वभूमीपासून स्पष्टपणे ओळखली जाऊ शकत नाही.त्यानंतर, फ्लोरोसेन्स वाढते आणि घातांक टप्प्यात प्रवेश करते.PCR उत्पादनाची मात्रा एका विशिष्ट टप्प्यावर शोधली जाऊ शकते जेव्हा PCR प्रतिक्रिया फक्त घातांक टप्प्यात असते, ज्याचा वापर "उत्पादनाची विशिष्ट रक्कम" म्हणून केला जाऊ शकतो आणि यावरून टेम्पलेटची प्रारंभिक सामग्री काढली जाऊ शकते.म्हणून, उत्पादनाच्या विशिष्ट प्रमाणाशी संबंधित फ्लोरोसेन्स सिग्नलची तीव्रता ही फ्लोरोसेन्स थ्रेशोल्ड आहे.

पीसीआरच्या शेवटच्या टप्प्यात, प्रवर्धन वक्र यापुढे घातांकीय प्रवर्धन दर्शवित नाही, आणि रेखीय टप्प्यात आणि पठार टप्प्यात प्रवेश करते.

3. Ct मूल्यांची पुनरुत्पादनक्षमता
जेव्हा PCR सायकल Ct मूल्याच्या सायकल क्रमांकापर्यंत पोहोचते, तेव्हा ते खर्‍या घातांकीय प्रवर्धन कालावधीत प्रवेश करते.यावेळी, लहान त्रुटी वाढविली गेली नाही, म्हणून Ct मूल्याची पुनरुत्पादकता उत्कृष्ट आहे, म्हणजेच, समान टेम्पलेट वेगवेगळ्या वेळी किंवा वेगवेगळ्या ट्यूबमध्ये एकाच वेळी वाढवले ​​जाते.प्रवर्धन, प्राप्त केलेले Ct मूल्य स्थिर आहे.

1.प्रवर्धन कार्यक्षमता इं
पीसीआर प्रवर्धक कार्यक्षमता ही कार्यक्षमतेचा संदर्भ देते ज्याद्वारे पॉलिमरेझ जीनला अॅम्प्लीकॉनमध्ये रूपांतरित करते.जेव्हा एका DNA रेणूचे दोन DNA रेणूंमध्ये रूपांतर होते तेव्हा प्रवर्धन कार्यक्षमता 100% असते.प्रवर्धन कार्यक्षमता सामान्यतः En म्हणून व्यक्त केली जाते.त्यानंतरच्या लेखांचे विश्लेषण सुलभ करण्यासाठी, प्रवर्धन कार्यक्षमतेवर परिणाम करणारे घटक थोडक्यात सादर केले आहेत.

2.Ct मूल्यांची श्रेणी
Ct मूल्यांची श्रेणी 15-35 पर्यंत असते.जर सीटी मूल्य 15 पेक्षा कमी असेल, तर असे मानले जाते की प्रवर्धन बेसलाइन कालावधीच्या मर्यादेत आहे आणि फ्लूरोसेन्स थ्रेशोल्ड गाठला गेला नाही.तद्वतच, Ct मूल्य आणि टेम्प्लेटच्या प्रारंभिक प्रत क्रमांकाच्या लॉगरिदममध्ये, म्हणजे, मानक वक्र यांच्यात एक रेषीय संबंध आहे.मानक वक्र द्वारे, जेव्हा प्रवर्धन कार्यक्षमता 100% असते, तेव्हा जनुकाच्या एकल प्रत क्रमांकाचे परिमाण करण्यासाठी गणना केलेले Ct मूल्य सुमारे 35 असते. जर ते 35 पेक्षा जास्त असेल, तर टेम्पलेटची प्रारंभिक प्रत संख्या सैद्धांतिकदृष्ट्या 1 पेक्षा कमी असते, जी निरर्थक मानली जाऊ शकते.

वेगवेगळ्या जीन सीटी श्रेणींसाठी, जीन कॉपी नंबर आणि प्रवर्धन कार्यक्षमतेमध्ये प्रारंभिक टेम्पलेट रकमेतील फरकामुळे, जनुकासाठी एक मानक वक्र तयार करणे आणि जनुकाच्या रेषीय शोध श्रेणीची गणना करणे आवश्यक आहे.

3.Ct मूल्यावर प्रभाव टाकणारे घटक
प्रवर्धक चक्रांची संख्या आणि उत्पादनाची रक्कम यांच्यातील संबंधांवरून: प्रवर्धित उत्पादनाची रक्कम = प्रारंभिक टेम्पलेटची रक्कम × (1+En) सायकल क्रमांक, हे पाहिले जाऊ शकते की आदर्श परिस्थितीत, प्रारंभिक टेम्पलेट आणि En चे प्रमाण Ct मूल्यावर नकारात्मक परिणाम करेल.टेम्प्लेट गुणवत्तेतील फरक किंवा प्रवर्धन कार्यक्षमतेमुळे Ct मूल्य खूप मोठे किंवा खूप लहान असेल.

4.Ct मूल्य खूप मोठे किंवा खूप लहान आहे