आण्विक निदान तंत्रज्ञान मानवी शरीराच्या अनुवांशिक सामग्रीची अभिव्यक्ती आणि रचना आणि विविध रोगजनकांचा शोध घेण्यासाठी आण्विक जीवशास्त्र पद्धती वापरते, ज्यामुळे रोगांचा अंदाज आणि निदान करण्याचा हेतू साध्य करता येतो.

अलिकडच्या वर्षांत, आण्विक निदान तंत्रज्ञानाच्या सुधारणा आणि पुनरावृत्तीसह, आण्विक निदानाचा नैदानिक ​​​​उपयोग अधिकाधिक व्यापक आणि सखोल झाला आहे आणि आण्विक निदान बाजाराने वेगवान विकासाच्या काळात प्रवेश केला आहे.

लेखक बाजारातील सामान्य आण्विक निदान तंत्रज्ञानाचा सारांश देतो आणि तीन भागांमध्ये विभागलेला आहे: पहिला भाग PCR तंत्रज्ञानाचा परिचय देतो, दुसरा भाग न्यूक्लिक अॅसिड समतापिक प्रवर्धन तंत्रज्ञानाचा परिचय देतो आणि दुसरा भाग अनुक्रम तंत्रज्ञानाचा परिचय देतो.

01

भाग I: पीसीआर तंत्रज्ञान

पीसीआर तंत्रज्ञान

पीसीआर (पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शन) हे 30 वर्षांहून अधिक इतिहासासह इन विट्रो डीएनए प्रवर्धन तंत्रज्ञानांपैकी एक आहे.

पीसीआर तंत्रज्ञानाची सुरुवात 1983 मध्ये कॅरी मुलिस ऑफ सेटस, यूएसए यांनी केली होती.मुलिस यांनी 1985 मध्ये पीसीआर पेटंटसाठी अर्ज केला आणि त्याच वर्षी विज्ञानावरील पहिला पीसीआर शैक्षणिक पेपर प्रकाशित केला.मुलिस यांना 1993 मध्ये रसायनशास्त्रातील नोबेल पारितोषिक मिळाले.

पीसीआरची मूलभूत तत्त्वे

पीसीआर लक्ष्यित डीएनए तुकड्यांना दहा लाखांहून अधिक वेळा वाढवू शकतो.तत्त्व असे आहे की डीएनए पॉलिमरेझच्या उत्प्रेरणा अंतर्गत, पॅरेंट स्ट्रँड डीएनए टेम्पलेट म्हणून वापरला जातो आणि विस्तारासाठी प्रारंभ बिंदू म्हणून विशिष्ट प्राइमर वापरला जातो.हे विट्रोमध्ये विकृतीकरण, अॅनिलिंग आणि विस्तार यांसारख्या चरणांद्वारे प्रतिरूपित केले जाते.मुलगी स्ट्रँड डीएनएची प्रक्रिया पालक स्ट्रँड टेम्पलेट डीएनएला पूरक आहे.

मानक पीसीआर प्रक्रिया तीन चरणांमध्ये विभागली आहे:

1. विकृतीकरण: DNA डबल स्ट्रँड वेगळे करण्यासाठी उच्च तापमान वापरा.DNA डबल स्ट्रँडमधील हायड्रोजन बंध उच्च तापमानात (93-98°C) तुटतात.

2. एनीलिंग: डबल-स्ट्रँडेड डीएनए विभक्त झाल्यानंतर, तापमान कमी केले जाते जेणेकरून प्राइमर सिंगल-स्ट्रँडेड डीएनएला बांधू शकेल.

3. विस्तार: तापमान कमी केल्यावर डीएनए पॉलिमरेझ बांधलेल्या प्राइमर्सपासून डीएनए स्ट्रँडसह पूरक स्ट्रँड्सचे संश्लेषण करण्यास सुरवात करते.जेव्हा विस्तार पूर्ण होतो, तेव्हा एक चक्र पूर्ण होते आणि DNA तुकड्यांची संख्या दुप्पट होते.

या तीन पायऱ्या 25-35 वेळा परस्पर केल्यास, DNA तुकड्यांची संख्या वेगाने वाढेल.

PCR ची कल्पकता अशी आहे की भिन्न प्राइमर्स वेगवेगळ्या लक्ष्य जनुकांसाठी डिझाइन केले जाऊ शकतात, ज्यामुळे लक्ष्य जनुकाचे तुकडे कमी कालावधीत वाढवता येतात.

आतापर्यंत, पीसीआरची तीन श्रेणींमध्ये विभागणी केली जाऊ शकते, म्हणजे सामान्य पीसीआर, फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक पीसीआर आणि डिजिटल पीसीआर.

सामान्य पीसीआरची पहिली पिढी

लक्ष्य जनुक वाढवण्यासाठी एक सामान्य पीसीआर प्रवर्धक साधन वापरा, आणि नंतर उत्पादन शोधण्यासाठी अॅग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस वापरा, केवळ गुणात्मक विश्लेषण केले जाऊ शकते.

पहिल्या पिढीच्या पीसीआरचे मुख्य तोटे:

-नॉन-विशिष्ट प्रवर्धन आणि चुकीच्या सकारात्मक परिणामांना प्रवण.

- शोधण्यात बराच वेळ लागतो आणि ऑपरेशन अवघड आहे.

-फक्त गुणात्मक चाचणी केली जाऊ शकते.

द्वितीय-जनरेशन फ्लोरोसेन्स परिमाणवाचक पीसीआर

फ्लूरोसेन्स क्वांटिटेटिव्ह PCR (रिअल-टाइम PCR), ज्याला qPCR असेही म्हणतात, याचा वापर फ्लोरोसेंट प्रोब जोडून फ्लोरोसेंट सिग्नलच्या संचयनाद्वारे वाढीव उत्पादनांच्या संचयनावर लक्ष ठेवण्यासाठी केला जातो जे प्रतिक्रिया प्रणालीची प्रगती दर्शवू शकतात आणि फ्लूरोसेन्स वक्र द्वारे परिणामांचा न्याय करण्यासाठी, आणि ते C च्या मानक वक्र मूल्याच्या मदतीने केले जाऊ शकते.

कारण qPCR तंत्रज्ञान बंद प्रणालीमध्ये चालते, दूषित होण्याची शक्यता कमी होते, आणि फ्लूरोसेन्स सिग्नलचे परिमाणात्मक तपासणीसाठी परीक्षण केले जाऊ शकते, म्हणून ते क्लिनिकल प्रॅक्टिसमध्ये सर्वात जास्त वापरले जाते आणि ते PCR मधील प्रबळ तंत्रज्ञान बनले आहे.

रिअल-टाइम फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक पीसीआरमध्ये वापरले जाणारे फ्लोरोसेंट पदार्थ यामध्ये विभागले जाऊ शकतात: TaqMan फ्लोरोसेंट प्रोब, आण्विक बीकन्स आणि फ्लोरोसेंट रंग.

1) TaqMan फ्लोरोसेंट प्रोब:

पीसीआर प्रवर्धनादरम्यान, प्राइमर्सची जोडी जोडताना एक विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोब जोडला जातो.प्रोब एक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड आहे आणि दोन टोकांना अनुक्रमे रिपोर्टर फ्लोरोसेंट ग्रुप आणि क्वेन्चर फ्लोरोसेंट ग्रुप असे लेबल केले आहे.

जेव्हा प्रोब अखंड असतो, तेव्हा रिपोर्टर ग्रुपद्वारे उत्सर्जित होणारा फ्लोरोसेंट सिग्नल शमन गटाद्वारे शोषला जातो;PCR प्रवर्धनादरम्यान, Taq एंझाइमची 5′-3′ exonuclease गतिविधी प्रोबला क्लीव्ह करते आणि खराब करते, ज्यामुळे रिपोर्टर फ्लोरोसेंट ग्रुप आणि क्वेंचर फ्लूरोसंट ग्रुप वेगळे केले जातात, जेणेकरून फ्लूरोसेन्स मॉनिटरींग सिस्टम फ्लूरोसेन्स सिग्नल प्राप्त करू शकते, म्हणजेच, प्रत्येक वेळी एक एमओएलए फॉर्म आणि डीएनए फ्लूरोसेंट आहे. फ्लोरोसेन्स सिग्नलचे संचय पीसीआर उत्पादनाच्या निर्मितीसह पूर्णपणे सिंक्रोनाइझ केले जाते.

2) SYBR फ्लोरोसेंट रंग:

पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणालीमध्ये, एसवायबीआर फ्लोरोसेंट डाईचा अतिरिक्त समावेश केला जातो.SYBR फ्लोरोसेंट डाई विशेषत: DNA डबल-स्ट्रँडमध्ये समाविष्ट केल्यानंतर, ते फ्लोरोसेंट सिग्नल उत्सर्जित करते.SYBR डाई रेणू जो साखळीमध्ये समाविष्ट केलेला नाही तो कोणताही फ्लोरोसेंट सिग्नल सोडणार नाही, ज्यामुळे फ्लोरोसेंट सिग्नलची खात्री होईल PCR उत्पादनांमध्ये वाढ PCR उत्पादनांच्या वाढीसह पूर्णपणे समक्रमित केली जाते.SYBR फक्त दुहेरी-असरलेल्या DNA ला बांधते, त्यामुळे PCR प्रतिक्रिया विशिष्ट आहे की नाही हे निर्धारित करण्यासाठी वितळण्याचा वक्र वापरला जाऊ शकतो.

3) आण्विक बीकन्स

हे एक स्टेम-लूप डबल-लेबल केलेले ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्रोब आहे जे 5 आणि 3 टोकांना सुमारे 8 बेसची हेअरपिन रचना बनवते.दोन्ही टोकांवरील न्यूक्लिक अॅसिड अनुक्रम पूरकपणे जोडलेले असतात, ज्यामुळे फ्लोरोसेंट गट आणि शमन गट घट्ट होतो.बंद करा, ते फ्लोरोसेन्स तयार करणार नाही.

पीसीआर उत्पादन तयार झाल्यानंतर, अॅनिलिंग प्रक्रियेदरम्यान, आण्विक बीकनचा मधला भाग एका विशिष्ट डीएनए अनुक्रमाने जोडला जातो आणि फ्लूरोसेन्ट जनुक क्वेन्चर जनुकापासून वेगळे केले जाते ज्यामुळे फ्लोरोसेन्स तयार होतो.

दुसऱ्या पिढीच्या पीसीआरचे मुख्य तोटे:

संवेदनशीलता अजूनही कमी आहे, आणि कमी-कॉपी नमुने शोधणे अचूक नाही.

पार्श्वभूमी मूल्य प्रभाव आहे, आणि परिणाम हस्तक्षेप संवेदनाक्षम आहे.

तिसरी पिढी डिजिटल पीसीआर

डिजिटल पीसीआर (डिजिटलपीसीआर, डीपीसीआर, डीआयजी-पीसीआर) अंतिम-बिंदू शोधाद्वारे लक्ष्य क्रमाच्या कॉपी क्रमांकाची गणना करते आणि अंतर्गत नियंत्रणे आणि मानक वक्र न वापरता अचूक परिपूर्ण परिमाणवाचक ओळख करू शकते.

डिजिटल PCR एंडपॉइंट डिटेक्शन वापरते आणि Ct मूल्यावर (सायकल थ्रेशोल्ड) अवलंबून नसते, त्यामुळे डिजिटल PCR प्रतिक्रिया प्रवर्धन कार्यक्षमतेमुळे कमी प्रभावित होते आणि उच्च अचूकता आणि पुनरुत्पादनक्षमतेसह PCR प्रतिक्रिया अवरोधकांना सहनशीलता सुधारली जाते.

उच्च संवेदनशीलता आणि उच्च अचूकतेच्या वैशिष्ट्यांमुळे, PCR प्रतिक्रिया अवरोधकांकडून यात सहजासहजी हस्तक्षेप होत नाही आणि ते प्रमाणित उत्पादनांशिवाय खरे परिपूर्ण परिमाण प्राप्त करू शकते, जे संशोधन आणि अनुप्रयोगाचे हॉटस्पॉट बनले आहे.

प्रतिक्रिया युनिटच्या विविध प्रकारांनुसार, ते तीन प्रकारांमध्ये विभागले जाऊ शकते: मायक्रोफ्लुइडिक, चिप आणि ड्रॉपलेट सिस्टम.