डायरेक्ट पीसीआर ही एक प्रतिक्रिया आहे जी न्यूक्लिक अॅसिड काढल्याशिवाय प्रवर्धनासाठी प्राणी किंवा वनस्पतींच्या ऊतींचा थेट वापर करते.अनेक प्रकारे, डायरेक्ट पीसीआर नियमित पीसीआर प्रमाणे कार्य करते

मुख्य फरक थेट पीसीआरमध्ये वापरला जाणारा सानुकूल बफर आहे, न्युक्लिक अॅसिड काढल्याशिवाय नमुना थेट पीसीआर प्रतिक्रियेच्या अधीन केला जाऊ शकतो, परंतु एंजाइमच्या सहनशीलतेसाठी आणि थेट पीसीआर प्रतिक्रियेमध्ये समाविष्ट असलेल्या बफरच्या सुसंगततेसाठी संबंधित आवश्यकता आहेत.

जरी सामान्य नमुन्यांमध्ये कमी किंवा जास्त पीसीआर इनहिबिटर आहेत, तरीही थेट पीसीआर एंजाइम आणि बफरच्या कृती अंतर्गत विश्वसनीय प्रवर्धन प्राप्त करू शकते.पारंपारिक पीसीआर प्रतिक्रियेसाठी टेम्पलेट म्हणून उच्च-गुणवत्तेच्या न्यूक्लिक अॅसिडची आवश्यकता असते, जर टेम्पलेटमध्ये प्रथिने आणि इतर अशुद्धता असतील तर ते पीसीआर प्रतिक्रियेच्या सुरळीत प्रगतीस प्रतिबंध करू शकतात.डायरेक्ट पीसीआर हे सध्या आण्विक निदान क्षेत्रातील सर्वात लोकप्रिय तंत्रज्ञानांपैकी एक आहे.

01 डायरेक्ट पीसीआर मूलतः प्राणी आणि वनस्पतींसाठी वापरला जात असे

डायरेक्ट पीसीआरचा सर्वात जुना वापर प्राणी आणि वनस्पतींच्या क्षेत्रात केला जातो, जसे की उंदीर, मांजर, कोंबडी, ससा, मेंढी, गुरे इत्यादींचे रक्त, ऊती आणि केस, वनस्पतीची पाने आणि बिया इत्यादी, जीनोटाइपिंग, ट्रान्सजेनिक, प्लाझमिड डिटेक्शन, जीन नॉकआउट स्त्रोत आणि एसएनए ओळख विश्लेषण, एसपीएन फील्ड, एसपीएन विश्लेषण, इतर विश्लेषणे यांचा अभ्यास करण्यासाठी वापरला जातो. s

या फील्डमध्ये काही सामान्य वैशिष्ट्ये आहेत, ती म्हणजे, लक्ष्य जनुक सामग्री तुलनेने जास्त आहे आणि न्यूक्लिक अॅसिड काढणे त्रासदायक आहे, त्यामुळे थेट पीसीआर केवळ वेळ वाचवू शकत नाही आणि परिणामांवर थोडासा प्रभाव टाकू शकत नाही तर खर्च देखील वाचवू शकतो.

पॅथोजेन शोधण्यासाठी वापरला जाणारा डायरेक्ट पीसीआर ही अलीकडच्या काळातील बाब आहे, काही पीसीआर अभिकर्मक उत्पादकांनी नावीन्य आणताना या दिशेने बरेच प्रयत्न केले आहेत.विशेषत: या कोविड-19 महामारीमध्ये, अशी अनेक शोध उत्पादने बाजारात आली आहेत, जसे की SARS-CoV-2 न्यूक्लिक अॅसिड डिटेक्शन किट (मल्टीप्लेक्स पीसीआर फ्लूरोसंट प्रोब मेथड) फोरजीनने संशोधन केलेले आणि विकसित केले आहे, जे रियल-टाइम आरटी पीसीआर तंत्रज्ञान (rRT-PCR) चा वापर करते oropharyngeal स्वॅब नमुने.

फोरजीन ही सामान्य ORF1ab, N, E, आणि शोधण्यासाठी डायरेक्ट पीसीआर तंत्रज्ञान वापरणाऱ्या कंपन्यांपैकी एक आहे.प्रकार SARS-CoV-2 B.1.1.7 वंश (UK), B.1.351 वंश (ZA), B.1.617 वंश (IND) आणि P.1 वंश (BR) सारख्या मानवी नासोफरींजियल किंवा ऑरोफरींजियल स्वॅब नमुन्यांमधील न्यूक्लिक अॅसिडचे वंश.

02  थेट पीसीआरसाठी अभिकर्मक आवश्यक आहेत

नमुना Lysate

नमुना लाइसेट स्वतः कॉन्फिगर केला जाऊ शकतो किंवा खरेदी केला जाऊ शकतो.लाइसेटच्या वेगवेगळ्या ब्रँडच्या रचनेतील फरकामुळे लायझिंग क्षमता वेगळी होईल आणि नंतर लायझिंगची वेळ थोडी वेगळी असेल.उदाहरणार्थ, प्राण्यांच्या ऊतींचे नमुने तयार करण्यासाठी, साधारणपणे 30 मिनिटे किंवा रात्रभर लिसिसची शिफारस केली जाते आणि व्हायरससाठी लिसिस सोल्यूशन 3-10 मिनिटांपर्यंत असते.

पीसीआर मास्टर मिक्स

विशिष्ट प्रवर्धन वाढविण्यासाठी आणि प्रवर्धन क्षमता वाढविण्यासाठी हॉट-स्टार्ट डीएनए पॉलिमरेझ वापरण्याची शिफारस केली जाते.डायरेक्ट पीसीआरचा गाभा हा अत्यंत सहनशील पॉलिमरेज आहे.

डीएनए प्रवर्धन प्रभावित करणारे नमुन्यातील घटक काढून टाका किंवा प्रतिबंधित करा

नमुन्यावर लाइसेटसह प्रक्रिया केल्यानंतर, प्रथिने, लिपिड आणि इतर सेल मोडतोड सोडली जाईल, हे पदार्थ पीसीआर प्रतिक्रिया रोखतील.म्हणून, थेट पीसीआरमध्ये या घटकांचा प्रभाव कमी करण्यासाठी संबंधित काढून टाकणे किंवा अवरोधक जोडणे आवश्यक आहे.

03  थेट पीसीआरच्या पाच ज्ञान बिंदूंचा संग्रह

प्रथम, डायरेक्ट पीसीआर तंत्रज्ञान हे विविध जैविक नमुन्यांसाठी थेट पीसीआर तंत्रज्ञान आहे.या तांत्रिक स्थितीनुसार, न्यूक्लिक अॅसिड वेगळे करण्याची आणि काढण्याची गरज नाही, थेट ऊतींचे नमुना ऑब्जेक्ट म्हणून वापरणे आणि PCR प्रतिक्रिया करण्यासाठी लक्ष्यित जनुक प्राइमर्स जोडणे आवश्यक आहे.

दुसरे, डायरेक्ट पीसीआर तंत्रज्ञान हे केवळ पारंपारिक डीएनए टेम्प्लेट अॅम्प्लिफिकेशन तंत्रज्ञान नाही तर त्यात आरएनए टेम्पलेट रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन पीसीआर देखील समाविष्ट आहे.

तिसरे, डायरेक्ट पीसीआर तंत्रज्ञान केवळ ऊतींच्या नमुन्यांवर नियमित गुणात्मक पीसीआर प्रतिक्रियाच करत नाही, तर रिअल-टाइम qPCR प्रतिक्रिया देखील समाविष्ट करते, ज्यासाठी प्रतिक्रिया प्रणालीमध्ये मजबूत पार्श्वभूमी प्रतिदीप्ति हस्तक्षेप क्षमता असणे आवश्यक आहे आणि अंतर्जात प्रतिदीप्ति विरोधी क्षमता शमन करते.

चौथे, डायरेक्ट पीसीआर तंत्रज्ञानाद्वारे लक्ष्यित केलेल्या नमुन्यांना फक्त न्यूक्लिक अॅसिड टेम्पलेट्स सोडण्याची आवश्यकता असते आणि पीसीआर प्रतिक्रियेमध्ये व्यत्यय आणणारी प्रथिने, पॉलिसेकेराइड्स, मीठ आयन इ. काढून टाकू नका.ज्यासाठी प्रतिक्रिया प्रणालीमध्ये न्यूक्लिक अॅसिड पॉलिमरेझ आणि पीसीआर मिक्समध्ये उत्कृष्ट प्रतिकार आणि अनुकूलता असणे आवश्यक आहे जेणेकरून एंझाइम क्रियाकलाप आणि जटिल परिस्थितीत प्रतिकृती अचूकता सुनिश्चित होईल.

पाचवे, कोणत्याही न्यूक्लिक अॅसिड संवर्धन उपचाराशिवाय डायरेक्ट पीसीआर तंत्रज्ञानाद्वारे लक्ष्यित टिश्यू सॅम्पल आणि टेम्प्लेटचे प्रमाण खूपच कमी आहे, ज्यासाठी प्रतिक्रिया प्रणालीमध्ये अत्यंत संवेदनशीलता आणि प्रवर्धन कार्यक्षमता असणे आवश्यक आहे.