माझा विश्वास आहे की पीसीआर प्रतिक्रिया करताना प्रत्येकाला नेहमीच अशा किंवा अशा समस्या येतात, परंतु त्यापैकी बहुतेकांना दोन मुख्य समस्यांमध्ये वर्गीकृत केले जाऊ शकते:

जनुक टेम्पलेटचे खूप कमी प्रवर्धन (प्रवर्धन);
खूप जास्त नॉन-लक्ष्य जनुक प्रवर्धन.
या समस्यांचे निराकरण करण्यासाठी additives वापरणे ही एक सामान्य रणनीती आहे.सहसा ऍडिटीव्हच्या भूमिकेचे दोन पैलू असतात:
दुय्यम रचनाजनुकांची (दुय्यम रचना);
नॉन-विशिष्ट प्राइमिंग कमी करा.
आज, संपादक तुम्हाला पीसीआर प्रतिक्रियांमधील सामान्य ऍडिटीव्ह आणि त्यांच्या कार्यांची थोडक्यात ओळख करून देतील.
दुय्यम संरचना कमी करणारे additives
सल्फोक्साइड(DMSO)
जनुकांचे नमुनेउच्च GC सामग्रीसह.तथापि, DMSO देखील Taq पॉलिमरेझ क्रियाकलाप मोठ्या प्रमाणात कमी करते.म्हणून, प्रत्येकाला टेम्पलेट प्रवेशयोग्यता आणि पॉलिमरेजची क्रिया संतुलित करावी लागेल.संपादक सुचवतो की तुम्ही तुमच्या प्रयोगाला अनुकूल असलेली एकाग्रता शोधण्यासाठी DSMO ची भिन्न सांद्रता वापरून पाहू शकता, जसे की 2% ते 10%.
नॉन-आयनिक डिटर्जंट्स
नॉन-आयोनिक डिटर्जंट्स, जसे की 0.1-1% ट्रायटन X-100, ट्वीन 20 किंवा NP-40, सहसा डीएनए दुय्यम संरचना कमी करतात.जरी यामुळे टेम्प्लेट जनुकाचे प्रवर्धन वाढू शकते, परंतु यामुळे विशिष्ट नसलेल्या प्रवर्धनाचा त्रास देखील होईल.तर, हे ऍडिटीव्ह कमी-उत्पन्न PCR प्रतिक्रियांसाठी मोडतोड न करता चांगले कार्य करतात, परंतु तुलनेने अशुद्ध PRC प्रतिक्रियांसाठी इतके चांगले नाही.नॉन-आयनिक डिटर्जंट्सचा आणखी एक फायदा म्हणजे एसडीएस दूषितता कमी करणे.सामान्यतः डीएनए काढण्याच्या प्रक्रियेदरम्यान, एसडीएसला पीसीआर चरणात आणले जाईल, जे पॉलिमरेझच्या क्रियाकलापांना मोठ्या प्रमाणात प्रतिबंधित करते.म्हणून, प्रतिक्रियेमध्ये 0.5% Tween-20 किंवा Tween-40 जोडल्याने SDS चे नकारात्मक परिणाम निष्प्रभावी होऊ शकतात.
बेटेन_
Betaine दुय्यम संरचना कमी करून DNA प्रवर्धन सुधारू शकते आणि सामान्यत: व्यावसायिक PCR किटमध्ये एक "गूढ" जोडणी आहे.तुम्हाला betaine वापरायचे असल्यास, तुम्ही betaine किंवा betaine mono-hydrate (Betaine किंवा Betaine mono-hydrate), पण betaine hydrochloride (Betaine HCl) नको, 1-1.7M च्या अंतिम एकाग्रतेशी जुळवून घ्या.बेटेन विशिष्टता सुधारण्यास देखील मदत करू शकते कारण ते डीएनए वितळणे/डीएनए विकृतीकरणाची बेस जोडी रचना अवलंबित्व काढून टाकते.
नॉन-विशिष्ट प्राइमिंग कमी करण्यासाठी अॅडिटीव्ह
फॉर्मामाइड
फॉर्मामाइड हे सामान्यतः वापरले जाणारे सेंद्रिय पीसीआर अॅडिटीव्ह आहे.हे डीएनए मधील प्रमुख खोबणी आणि किरकोळ खोबणीसह एकत्र करू शकते, ज्यामुळे मास्टर डीएनए दुहेरी हेलिक्सची स्थिरता कमी होते आणि डीएनएचे वितळण्याचे तापमान कमी होते.पीसीआर प्रयोगांमध्ये वापरल्या जाणार्‍या फॉर्मॅमाइडची एकाग्रता सामान्यतः 1%-5% असते.
टेट्रामेथिलअमोनियम क्लोराईड( TMAC)
टेट्रामेथिलामोनियम क्लोराईड संकरीकरणाची विशिष्टता (संकरीकरण विशिष्टता) वाढवू शकते आणि डीएनएचे वितळण्याचे तापमान वाढवू शकते.अशा प्रकारे, TMAC गैर-विशिष्ट प्राइमिंग काढून टाकू शकते आणि DNA आणि RNA चे चुकीचे बंधन कमी करू शकते.आपण वापरत असल्यासडिजनरेट प्राइमर्सPCR प्रतिक्रिया मध्ये, TMAC जोडण्याचे लक्षात ठेवा, जे सामान्यतः 15-100mM च्या एकाग्रतेमध्ये वापरले जाते.
इतर सामान्य additives
वर नमूद केलेल्या दोन श्रेणींच्या ऍडिटीव्ह व्यतिरिक्त, पीसीआर प्रतिक्रियांमध्ये अनेक सामान्य ऍडिटीव्ह आहेत, जरी त्यांची कार्ये भिन्न आहेत, ती देखील खूप महत्वाची आहेत.
मॅग्नेशियम आयन
मॅग्नेशियम आयन हे पॉलिमरेझचे अपरिहार्य कोफॅक्टर (कोफॅक्टर) आहे, म्हणजेच मॅग्नेशियम आयनशिवाय, पॉलिमरेझ निष्क्रिय आहे.तथापि, खूप जास्त मॅग्नेशियम आयन देखील पॉलिमरेझच्या कार्यक्षमतेवर परिणाम करू शकतात.प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रियेमध्ये मॅग्नेशियम आयनची एकाग्रता भिन्न असेल.चेलेटिंग एजंट्स (जसे की EDTA किंवा सायट्रेट), dNTPs आणि प्रथिने यांची एकाग्रता मॅग्नेशियम आयनच्या एकाग्रतेवर परिणाम करते.म्हणून, जर तुम्हाला तुमच्या पीसीआर प्रयोगात समस्या येत असतील, तर तुम्ही मॅग्नेशियम आयनची भिन्न सांद्रता बदलण्याचा प्रयत्न करू शकता, उदाहरणार्थ, 1.0 ते 4.0mM पर्यंत, 0.5-1mM दरम्यानच्या अंतराने.
हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की एकाधिक फ्रीझ-थॉ चक्रांमुळे मॅग्नेशियम क्लोराईड द्रावणाचे एकाग्रता स्तरीकरण होऊ शकते.म्हणून, प्रत्येक वापरापूर्वी तुम्ही ते पूर्णपणे विरघळले पाहिजे आणि ते वापरण्यापूर्वी चांगले मिसळा.
बोवाइन सीरम अल्ब्युमिन(बोवाइन अल्ब्युमिन, BSA)
आण्विक रसायनशास्त्राच्या प्रयोगांमध्ये, बोवाइन सीरम अल्ब्युमिन हे एक अतिशय सामान्य पदार्थ आहे, विशेषत: निर्बंध एंझाइम पचन आणि पीसीआर प्रयोगांमध्ये.PCR प्रतिक्रियांमध्ये, BSA हे फेनोलिक संयुगे सारख्या दूषित घटकांना कमी करण्यासाठी उपयुक्त आहे.आणि असेही म्हटले जाते की ते चाचणी ट्यूबच्या भिंतीवरील अभिक्रियाकांचे आसंजन कमी करू शकते.पीसीआर प्रतिक्रियेमध्ये, सहसा जोडलेल्या BSA ची एकाग्रता 0.8 mg/ml पर्यंत पोहोचू शकते.
 
संबंधित उत्पादने:
पीसीआर हिरो(रंगाने)
पीसीआर हिरो