• पीसीआर ही एक पद्धत आहे जी डीएनए टेम्प्लेटच्या थोड्या प्रमाणात डीएनए वाढवण्यासाठी वापरली जाते.RT-PCR रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनचा वापर करून आरएनए स्त्रोताकडून डीएनए टेम्प्लेट तयार करते जे नंतर वाढवले ​​जाऊ शकते.
• पीसीआर आणि आरटी-पीसीआर या सामान्यत: एंडपॉइंट प्रतिक्रिया असतात, तर qPCR आणि RT-qPCR पीसीआर प्रतिक्रियेदरम्यान उत्पादनाच्या संश्लेषणाच्या दराच्या गतीशास्त्राचा वापर करून उपस्थित टेम्पलेटचे प्रमाण मोजतात.
• नवीन पद्धती, जसे की डिजिटल पीसीआर, सुरुवातीच्या डीएनए टेम्पलेटचे परिपूर्ण परिमाण प्रदान करतात, तर आयसोथर्मल पीसीआर सारख्या पद्धती विश्वसनीय परिणाम प्रदान करण्यासाठी महागड्या उपकरणांची आवश्यकता कमी करतात.

पॉलिमरेझ चेन रिएक्शन (पीसीआर) हे डीएनए आणि आरएनए अनुक्रम वाढवण्यासाठी आणि शोधण्यासाठी तुलनेने सोपे आणि मोठ्या प्रमाणावर वापरले जाणारे आण्विक जीवशास्त्र तंत्र आहे.डीएनए क्लोनिंग आणि अॅम्प्लीफिकेशनच्या पारंपारिक पद्धतींच्या तुलनेत, ज्यात अनेकदा दिवस लागू शकतात, पीसीआरला फक्त काही तास लागतात.पीसीआर अत्यंत संवेदनशील आहे आणि विशिष्ट अनुक्रम शोधण्यासाठी आणि वाढवण्यासाठी किमान टेम्पलेट आवश्यक आहे.मूलभूत पीसीआर पद्धती साध्या डीएनए आणि आरएनए शोधण्यापासून पुढे प्रगत झाल्या आहेत.खाली, आम्ही तुमच्या संशोधन गरजांसाठी एन्झो लाइफ सायन्सेस येथे पुरवलेल्या वेगवेगळ्या पीसीआर पद्धती आणि अभिकर्मकांचे विहंगावलोकन दिले आहे.शास्त्रज्ञांना त्यांच्या पुढील संशोधन प्रकल्पात PCR अभिकर्मकांचा त्वरीत वापर करण्यास मदत करण्याचे आमचे ध्येय आहे!

पीसीआर

मानक पीसीआरसाठी, तुम्हाला फक्त डीएनए पॉलिमरेझ, मॅग्नेशियम, न्यूक्लियोटाइड्स, प्राइमर्स, विस्तारित करण्यासाठी डीएनए टेम्पलेट आणि थर्मोसायकलची आवश्यकता आहे.PCR यंत्रणा त्याच्या उद्देशाइतकीच सोपी आहे: 1) डबल-स्ट्रॅंडेड DNA (dsDNA) हीट डिनेचर्ड आहे, 2) प्राइमर्स सिंगल DNA स्ट्रँडशी संरेखित होतात आणि 3) प्राइमर्स डीएनए पॉलिमरेझद्वारे वाढवले ​​जातात, परिणामी त्याच्या दोन प्रती तयार होतात. मूळ डीएनए स्ट्रँड.तापमान आणि वेळेच्या मालिकेतील विकृतीकरण, एनीलिंग आणि वाढवण्याची प्रक्रिया प्रवर्धनाचे एक चक्र म्हणून ओळखली जाते (चित्र 1).

सायकलचा प्रत्येक टप्पा वापरलेल्या टेम्पलेट आणि प्राइमर सेटसाठी ऑप्टिमाइझ केला पाहिजे.हे चक्र अंदाजे 20-40 वेळा पुनरावृत्ती होते, आणि वाढीव उत्पादनाचे विश्लेषण केले जाऊ शकते, विशेषत: ऍगारोज जेल (चित्र 2).

पीसीआर ही एक अत्यंत संवेदनशील पद्धत असल्याने आणि एकल प्रतिक्रियांसाठी फारच लहान व्हॉल्यूम आवश्यक असल्याने, अनेक प्रतिक्रियांसाठी मास्टर मिक्स तयार करण्याची शिफारस केली जाते.मास्टर मिक्स चांगले मिसळले पाहिजे आणि नंतर प्रतिक्रियांच्या संख्येनुसार विभाजित केले पाहिजे, प्रत्येक प्रतिक्रियेमध्ये समान प्रमाणात एंजाइम, dNTPs आणि प्राइमर्स असतील याची खात्री करा.एन्झो लाइफ सायन्सेस सारखे अनेक पुरवठादार PCR मिक्स देखील देतात ज्यात प्राइमर आणि DNA टेम्प्लेट वगळता सर्व काही आधीच असते.

Guanine/Cytosine-rich (GC-rich) प्रदेश मानक PCR तंत्रात एक आव्हान दर्शवतात.GC-युक्त अनुक्रम कमी GC सामग्री असलेल्या अनुक्रमांपेक्षा अधिक स्थिर असतात.शिवाय, GC-युक्त अनुक्रम हेअरपिन लूप सारख्या दुय्यम संरचना तयार करतात.परिणामी, जीसी-समृद्ध दुहेरी स्ट्रँड विकृतीकरण टप्प्यात पूर्णपणे वेगळे करणे कठीण आहे.परिणामी, डीएनए पॉलिमरेझ नवीन स्ट्रँडचे संश्लेषण कोणत्याही अडथळ्याशिवाय करू शकत नाही.उच्च विकृती तापमान हे सुधारू शकते, आणि उच्च अॅनिलिंग तापमान आणि कमी अॅनिलिंग वेळेसाठी समायोजन GC-युक्त प्राइमर्सचे अनिश्चित बंधन टाळू शकते.अतिरिक्त अभिकर्मक GC-युक्त अनुक्रमांचे प्रवर्धन वाढवू शकतात.DMSO, ग्लिसरॉल आणि बेटेन GC परस्परसंवादामुळे होणार्‍या दुय्यम संरचनांमध्ये व्यत्यय आणण्यास मदत करतात आणि त्याद्वारे दुहेरी स्ट्रँड वेगळे करणे सुलभ करतात.

हॉट स्टार्ट पीसीआर

अनिर्दिष्ट प्रवर्धन ही एक समस्या आहे जी पीसीआर दरम्यान येऊ शकते.PCR साठी वापरल्या जाणार्‍या बहुतेक DNA पॉलिमरेसेस 68°C ते 72°C तापमानात उत्तम काम करतात.एंझाइम, तथापि, कमी तापमानात देखील सक्रिय असू शकते, जरी कमी प्रमाणात.अॅनिलिंग तापमानापेक्षा खूपच कमी तापमानात, प्राइमर विशिष्टपणे बांधून ठेवू शकतात आणि प्रतिक्रिया बर्फावर सेट केली असली तरीही, विशिष्ट प्रवर्धन होऊ शकते.हे पॉलीमरेझ इनहिबिटर वापरून प्रतिबंधित केले जाऊ शकते जे डीएनए पॉलिमरेझपासून विलग होतात एकदाच विशिष्ट तापमान गाठले जाते, म्हणून हॉट स्टार्ट पीसीआर ही संज्ञा.इनहिबिटर एक अँटीबॉडी असू शकतो जो सुरुवातीच्या विकृतीकरण तापमानात (सामान्यत: 95°C) पॉलिमरेज आणि डेन्चर्सला बांधतो.

उच्च निष्ठा पॉलिमरेझ

डीएनए पॉलिमरेसेस मूळ टेम्प्लेट अनुक्रमात अगदी अचूकपणे वाढवतात, तर न्यूक्लियोटाइड जुळणीमध्ये चुका होऊ शकतात.क्लोनिंग सारख्या ऍप्लिकेशन्समधील जुळत नसल्यामुळे ट्रंकटेड ट्रान्स्क्रिप्ट आणि चुकीचे भाषांतरित किंवा निष्क्रिय प्रथिने डाउनस्ट्रीम होऊ शकतात.या विसंगती टाळण्यासाठी, "प्रूफरीडिंग" क्रियाकलाप असलेले पॉलिमरेस ओळखले गेले आहेत आणि वर्कफ्लोमध्ये समाविष्ट केले आहेत.प्रथम प्रूफरीडिंग पॉलिमरेझ, पीफू, 1991 मध्ये पायरोकोकस फ्युरियोससमध्ये ओळखले गेले.या Pfu एंझाइममध्ये 3' ते 5' exonuclease क्रियाकलाप आहे.जसजसे डीएनए वाढवले ​​जाते, तसतसे एक्सोन्यूक्लीज स्ट्रँडच्या 3' टोकाला न जुळणारे न्यूक्लियोटाइड काढून टाकते.योग्य न्यूक्लियोटाइड नंतर बदलले जाते, आणि डीएनए संश्लेषण चालू राहते.चुकीच्या न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमांची ओळख एंझाइमसह योग्य न्यूक्लियोसाइड ट्रायफॉस्फेटच्या बंधनकारक संबंधावर आधारित आहे, जेथे अकार्यक्षम बंधनामुळे संश्लेषण मंदावते आणि योग्य बदलण्याची परवानगी मिळते.Pfu पॉलिमरेझच्या प्रूफरीडिंग अ‍ॅक्टिव्हिटीमुळे अंतिम क्रमामध्ये Taq DNA पॉलिमरेझच्या तुलनेत कमी त्रुटी आढळतात.अलिकडच्या वर्षांत, इतर प्रूफरीडिंग एंजाइम ओळखले गेले आहेत, आणि डीएनए प्रवर्धनादरम्यान त्रुटी दर आणखी कमी करण्यासाठी मूळ Pfu एंझाइममध्ये बदल केले गेले आहेत.

RT-PCR

रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन PCR, किंवा RT-PCR, RNA चा टेम्पलेट म्हणून वापर करण्यास अनुमती देते.एक अतिरिक्त पायरी आरएनए शोधणे आणि प्रवर्धन करण्यास अनुमती देते.रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस वापरून RNA पूरक DNA (cDNA) मध्ये उलट लिप्यंतरण केले जाते.RT-PCR च्या यशासाठी RNA टेम्पलेटची गुणवत्ता आणि शुद्धता आवश्यक आहे.RT-PCR ची पहिली पायरी म्हणजे DNA/RNA संकरित संश्लेषण.रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसमध्ये RNase H फंक्शन देखील असते, जे संकरित RNA भाग खराब करते.सिंगल-स्ट्रँडेड डीएनए रेणू नंतर सीडीएनएमध्ये रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेसच्या डीएनए-आश्रित डीएनए पॉलिमरेझ क्रियाकलापाने पूर्ण होतो.प्रथम-स्ट्रँड प्रतिक्रियेची कार्यक्षमता प्रवर्धन प्रक्रियेवर परिणाम करू शकते.इथून पुढे, सीडीएनए वाढवण्यासाठी मानक पीसीआर प्रक्रिया वापरली जाते.RT-PCR द्वारे RNA ला cDNA मध्ये परत करण्याच्या शक्यतेचे अनेक फायदे आहेत आणि ते प्रामुख्याने जनुक अभिव्यक्ती विश्लेषणासाठी वापरले जाते.RNA सिंगल-स्ट्रँडेड आणि खूप अस्थिर आहे, ज्यामुळे त्याच्यासोबत काम करणे आव्हानात्मक होते.हे सामान्यतः qPCR मधील पहिले पाऊल म्हणून काम करते, जे जैविक नमुन्यातील RNA प्रतिलेखांचे प्रमाण ठरवते.

qPCR आणि RT-qPCR

क्वांटिटेटिव्ह पीसीआर (qPCR) चा वापर असंख्य ऍप्लिकेशन्ससाठी न्यूक्लिक अॅसिड शोधण्यासाठी, वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी आणि त्याचे प्रमाण निश्चित करण्यासाठी केला जातो.RT-qPCR मध्ये, वर वर्णन केल्याप्रमाणे, RNA प्रतिलिपींना प्रथम cDNA मध्ये उलट प्रतिलेखन करून परिमाण निश्चित केले जाते, आणि नंतर qPCR नंतर चालते.मानक पीसीआर प्रमाणे, डीएनए तीन पुनरावृत्ती चरणांद्वारे वाढविला जातो: विकृतीकरण, एनीलिंग आणि वाढवणे.तथापि, qPCR मध्ये, फ्लोरोसेंट लेबलिंग PCR प्रगती करत असताना डेटाचे संकलन करण्यास सक्षम करते.उपलब्ध पद्धती आणि रसायनशास्त्रांच्या श्रेणीमुळे या तंत्राचे बरेच फायदे आहेत.

डाई-आधारित qPCR (सामान्यत: हिरवा) मध्ये, फ्लोरोसेंट लेबलिंग dsDNA बाइंडिंग डाईचा वापर करून वाढीव DNA रेणूंचे प्रमाणीकरण करण्यास अनुमती देते.प्रत्येक चक्रादरम्यान, फ्लोरोसेन्स मोजला जातो.प्रतिरूपित डीएनएच्या प्रमाणात फ्लोरोसेन्स सिग्नल वाढतो.म्हणून, डीएनएचे प्रमाण “रिअल-टाइम” (चित्र 3) मध्ये केले जाते.डाई-आधारित qPCR चे तोटे म्हणजे एका वेळी फक्त एक लक्ष्य तपासले जाऊ शकते आणि डाई नमुन्यात उपस्थित असलेल्या कोणत्याही ds-DNA ला बांधील.

प्रोब-आधारित qPCR मध्ये, प्रत्येक नमुन्यात एकाच वेळी अनेक लक्ष्ये शोधली जाऊ शकतात, परंतु यासाठी प्राइमर्स व्यतिरिक्त वापरलेल्या लक्ष्य-विशिष्ट प्रोबचे ऑप्टिमायझेशन आणि डिझाइन आवश्यक आहे.अनेक प्रकारच्या प्रोब डिझाइन्स उपलब्ध आहेत, परंतु सर्वात सामान्य प्रकार म्हणजे हायड्रोलिसिस प्रोब, ज्यामध्ये फ्लोरोफोर आणि क्वेंचर समाविष्ट आहे.फ्लूरोसेन्स रेझोनान्स एनर्जी ट्रान्सफर (FRET) प्रोब शाबूत असताना क्वेन्चरद्वारे फ्लोरोफोरचे उत्सर्जन रोखते.तथापि, पीसीआर प्रतिक्रियेदरम्यान, प्राइमरच्या विस्तारादरम्यान प्रोबचे हायड्रोलायझेशन केले जाते आणि त्यास बांधील असलेल्या विशिष्ट अनुक्रमाचे प्रवर्धन केले जाते.प्रोबचे क्लीवेज फ्लोरोफोरला क्वेन्चरपासून वेगळे करते आणि परिणामी फ्लोरोसेन्समध्ये प्रवर्धन-आधारित वाढ होते (चित्र 4).अशाप्रकारे, प्रोब-आधारित qPCR प्रतिक्रियेतील फ्लूरोसेन्स सिग्नल नमुन्यामध्ये उपस्थित असलेल्या प्रोब लक्ष्य क्रमाच्या प्रमाणात आहे.कारण प्रोब-आधारित qPCR हे डाई-आधारित qPCR पेक्षा अधिक विशिष्ट आहे, हे बहुधा qPCR-आधारित डायग्नोस्टिक अॅसेसमध्ये वापरले जाणारे तंत्रज्ञान आहे.

आइसोथर्मल प्रवर्धन

वर नमूद केलेल्या PCR तंत्रांना विकृतीकरण, ऍनिलिंग आणि विस्तार चरणांसाठी चेंबरचे तापमान अचूकपणे वर आणि खाली करण्यासाठी महागड्या थर्मोसायक्लिंग उपकरणांची आवश्यकता असते.अनेक तंत्रे विकसित केली गेली आहेत ज्यांना अशा अचूक उपकरणांची आवश्यकता नाही आणि ते साध्या पाण्याच्या बाथमध्ये किंवा स्वारस्य असलेल्या पेशींमध्ये देखील केले जाऊ शकतात.या तंत्रांना एकत्रितपणे समतापीय प्रवर्धन म्हणतात आणि घातांक, रेखीय किंवा कॅस्केड प्रवर्धनावर आधारित कार्य करतात.

लूप-मध्यस्थ समतापीय प्रवर्धन किंवा LAMP हा समस्थानिक प्रवर्धनाचा सर्वात प्रसिद्ध प्रकार आहे.LAMP टेम्पलेट DNA किंवा RNA वाढवण्यासाठी 65⁰C वर घातांकीय प्रवर्धन वापरते.LAMP करत असताना, नवीन DNA संश्लेषित करण्यासाठी DNA पॉलिमरेजसह लक्ष्यित DNA च्या क्षेत्रांना पूरक चार ते सहा प्राइमर्स वापरले जातात.यापैकी दोन प्राइमर्समध्ये पूरक अनुक्रम आहेत जे इतर प्राइमर्समधील अनुक्रम ओळखतात आणि त्यांना बांधतात, नवीन संश्लेषित DNA मध्ये "लूप" रचना तयार करण्यास अनुमती देते जी नंतर प्रवर्धनाच्या त्यानंतरच्या फेऱ्यांमध्ये प्राइमर अॅनिलिंग करण्यास मदत करते.फ्लूरोसेन्स, अॅग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस किंवा कलरमेट्री यासह अनेक पद्धतींनी LAMP ची कल्पना करता येते.कलरमेट्रीद्वारे उत्पादनाची उपस्थिती किंवा अनुपस्थिती दृश्‍यमान करणे आणि शोधणे आणि आवश्यक महागड्या उपकरणांच्या अभावामुळे LAMP ला SARS-CoV-2 चाचणीसाठी योग्य पर्याय बनवले जेथे क्लिनिकल लॅब चाचणी सहज उपलब्ध नव्हती, किंवा नमुने साठवणे आणि वाहतूक करणे. व्यवहार्य नव्हते, किंवा ज्या लॅबमध्ये पूर्वी पीसीआर थर्मोसायकलिंग उपकरणे नव्हती.