रिअल टाइम पीसीआर, ज्याला परिमाणात्मक पीसीआर किंवा क्यूपीसीआर म्हणूनही ओळखले जाते, ही पीसीआर प्रवर्धन उत्पादनांचे वास्तविक-वेळ निरीक्षण आणि विश्लेषण करण्याची एक पद्धत आहे.
परिमाणवाचक PCR मध्ये साधे ऑपरेशन, जलद आणि सोयीस्कर, उच्च संवेदनशीलता, चांगली पुनरावृत्तीक्षमता आणि कमी दूषित दराचे फायदे असल्यामुळे ते वैद्यकीय चाचणी, औषध परिणामकारकता मूल्यांकन, जनुक अभिव्यक्ती संशोधन, ट्रान्सजेनिक संशोधन, जनुक शोधणे, रोगजनक शोधणे, प्राणी आणि वनस्पती शोधणे यासाठी मोठ्या प्रमाणावर वापरले जाते., अन्न चाचणी आणि इतर फील्ड.
त्यामुळे, तुम्ही जीवन विज्ञानातील मूलभूत संशोधनात गुंतलेले असाल, किंवा फार्मास्युटिकल कंपन्या, पशुपालन कंपन्या, फूड कंपन्या, किंवा अगदी एंट्री-एक्झिट इन्स्पेक्शन आणि क्वारंटाईन ब्युरो, पर्यावरण निरीक्षण विभाग, रुग्णालये आणि इतर युनिट्सचे कर्मचारी, तुम्ही कमी-अधिक प्रमाणात संपर्कात असाल किंवा तुम्हाला PCR क्वांटिंगचे ज्ञान असणे आवश्यक आहे.

रिअल टाइम पीसीआरचे तत्त्व

रिअल टाइम पीसीआर ही एक पद्धत आहे ज्यामध्ये फ्लोरोसेंट पदार्थ पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणालीमध्ये जोडले जातात आणि पीसीआर प्रतिक्रियेच्या प्रक्रियेतील फ्लूरोसेन्स सिग्नल तीव्रतेचे रिअल टाइममध्ये परिमाणात्मक पीसीआर उपकरणाद्वारे परीक्षण केले जाते आणि शेवटी प्रायोगिक डेटाचे विश्लेषण आणि प्रक्रिया केली जाते.

【प्रवर्धन वक्र】PCR च्या डायनॅमिक प्रक्रियेचे वर्णन करणारा वक्र आहे.PCR चे प्रवर्धक वक्र प्रत्यक्षात मानक घातांकीय वक्र नसून एक सिग्मॉइड वक्र आहे.

[प्रवर्धन वक्रचा प्लॅटफॉर्म टप्पा]पीसीआर चक्रांची संख्या वाढल्याने, डीएनए पॉलिमरेझचे निष्क्रियीकरण, डीएनटीपी आणि प्राइमर्सचे क्षीण होणे आणि उप-उत्पादन पायरोफॉस्फेट इत्यादीद्वारे संश्लेषण प्रतिक्रिया रोखणे, इत्यादी, पीसीआर नेहमी वेगाने विस्तारत नाही., आणि शेवटी एका पठारात प्रवेश करेल.

[प्रवर्धन कर्वचा घातांकीय वाढ क्षेत्र]जरी पठारी अवस्था मोठ्या प्रमाणात बदलत असली तरी, प्रवर्धन वक्रच्या घातांकीय वाढीच्या प्रदेशात, पुनरावृत्ती योग्यता खूप चांगली आहे, जी पीसीआरच्या परिमाणात्मक विश्लेषणासाठी खूप महत्त्वाची आहे.

[थ्रेशोल्ड मूल्य आणि Ct मूल्य]आम्‍ही एम्‍प्लिफिकेशन वक्रच्‍या घातांकीय वाढीच्‍या क्षेत्रामध्‍ये, थ्रेशोल्‍ड व्हॅल्यू (थ्रेशोल्‍ड) म्‍हणजे योग्य स्‍थानावर फ्लूरोसेंस डिटेक्‍शनचे मर्यादा मूल्य सेट करतो.थ्रेशोल्ड मूल्य आणि प्रवर्धन वक्र यांचे छेदनबिंदू हे Ct मूल्य आहे, म्हणजे, जेव्हा थ्रेशोल्ड मूल्य गाठले जाते तेव्हा Ct मूल्य चक्रांची संख्या (थ्रेशोल्ड सायकल) दर्शवते.

खालील आलेख थ्रेशोल्ड रेषा आणि प्रवर्धन वक्र, थ्रेशोल्ड आणि Ct मूल्य यांच्यातील संबंध स्पष्टपणे दर्शवितो.

【परिमाण कसे ठरवायचे?】

हे गणितीय सिद्धांताद्वारे सिद्ध झाले आहे की Ct मूल्याचा प्रारंभिक टेम्पलेट्सच्या संख्येच्या लॉगरिथमशी व्यस्त रेषीय संबंध आहे.रिअल टाइम पीसीआर रिअल टाइममध्ये पीसीआर अॅम्प्लीफिकेशन उत्पादनांचे निरीक्षण करते आणि घातांकीय प्रवर्धन टप्प्यात त्यांचे प्रमाण ठरवते.

पीसीआरच्या प्रत्येक चक्रासाठी, डीएनए वेगाने 2 पटीने वाढला आणि लवकरच एका पठारावर पोहोचला.

सुरुवातीच्या DNA चे प्रमाण A आहे असे गृहीत धरून₀ , n चक्रांनंतर, DNA उत्पादनाची सैद्धांतिक रक्कम याप्रमाणे व्यक्त केली जाऊ शकते:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

त्यानंतर, प्रारंभिक DNA रक्कम A 0 जितकी जास्त असेल तितक्या लवकर वाढीव उत्पादनाची रक्कम शोध मूल्य An पर्यंत पोहोचते आणि An वर पोहोचल्यावर चक्रांची संख्या Ct मूल्य असते.म्हणजेच, प्रारंभिक DNA रक्कम A 0 जितकी जास्त असेल, तितक्या लवकर प्रवर्धन वक्र शिखरावर जाईल आणि त्यानुसार आवश्यक n चक्रांची संख्या कमी असेल.

आम्ही ज्ञात एकाग्रतेच्या मानकांचे ग्रेडियंट डायल्युशन करतो आणि ते रिअल टाइम पीसीआरसाठी टेम्पलेट म्हणून वापरतो आणि डीएनएची रक्कम अधिक ते कमी सुरू करण्याच्या क्रमाने समान अंतराने प्रवर्धन वक्रांची मालिका प्राप्त केली जाईल.Ct मूल्य आणि प्रारंभिक टेम्पलेट्सच्या संख्येच्या लॉगरिथममधील रेषीय संबंधानुसार, a[मानक वक्र] तयार केले जाऊ शकते.

प्रमाणित वक्र मध्ये अज्ञात एकाग्रतेसह नमुन्याचे Ct मूल्य बदलून, अज्ञात एकाग्रतेसह नमुन्याची प्रारंभिक टेम्पलेट रक्कम मिळवता येते, जे रिअल टाइम पीसीआरचे परिमाणवाचक तत्त्व आहे.

रिअल टाइम पीसीआर शोधण्याची पद्धत

रिअल टाइम पीसीआर रिअॅक्शन सिस्टममधील फ्लूरोसेन्स तीव्रता शोधून पीसीआर प्रवर्धन उत्पादने शोधते.

फ्लोरोसेंट डाई एम्बेडिंग पद्धतीचा सिद्धांत】

फ्लोरोसेंट रंग, जसे की TB Green ® , PCR सिस्टीममधील दुहेरी-अडकलेल्या DNA आणि बंधनकारक केल्यावर fluoresce ला विशिष्टपणे बांधू शकते.

पीसीआर चक्रांच्या वाढीसह प्रतिक्रिया प्रणालीमध्ये फ्लोरोसेन्सची तीव्रता वेगाने वाढली.फ्लूरोसेन्सची तीव्रता शोधून, रिअल टाइममध्ये रिअल टाइममध्ये डीएनए प्रवर्धनाचे प्रमाण तपासले जाऊ शकते आणि नंतर नमुन्यातील सुरुवातीच्या टेम्प्लेटच्या प्रमाणाचा उलट अंदाज लावला जाऊ शकतो.

【फ्लोरोसेंट प्रोब पद्धतीचा सिद्धांत】

फ्लोरोसेंट प्रोब5′ टोकाला फ्लोरोसेंट ग्रुप आणि 3′ टोकाला क्वेंचिंग ग्रुप असलेला न्यूक्लिक अॅसिड सीक्वेन्स आहे, जो विशेषत: टेम्प्लेटला बांधू शकतो.जेव्हा प्रोब अखंड असतो, तेव्हा फ्लोरोफोरद्वारे उत्सर्जित होणारा फ्लूरोसेन्स शमन गटाद्वारे शमन केला जातो आणि फ्लोरोसेस होऊ शकत नाही.जेव्हा प्रोब विघटित होते, तेव्हा फ्लोरोसेंट पदार्थ विलग होईल आणि फ्लोरोसेन्स उत्सर्जित करेल.

पीसीआर प्रतिक्रिया सोल्युशनमध्ये फ्लोरोसेंट प्रोब जोडला जातो.एनीलिंग प्रक्रियेदरम्यान, फ्लोरोसेंट प्रोब टेम्प्लेटच्या विशिष्ट स्थितीशी बांधील असेल.विस्तार प्रक्रियेदरम्यान, पीसीआर एंझाइमची 5′→3′ एक्सोन्यूक्लीझ क्रियाकलाप टेम्पलेटसह संकरित फ्लोरोसेंट प्रोबचे विघटन करू शकते आणि फ्लोरोसेंट पदार्थ फ्लोरोसेन्स उत्सर्जित करण्यासाठी विलग केला जातो.प्रतिक्रिया प्रणालीमध्ये प्रोबची फ्लोरोसेन्स तीव्रता शोधून, पीसीआर उत्पादनाच्या प्रवर्धन रकमेचे निरीक्षण करण्याचा हेतू साध्य केला जाऊ शकतो.

【फ्लोरोसेन्स शोध पद्धतीची निवड】

उच्च समरूपता असलेल्या अनुक्रमांमध्ये फरक करण्यासाठी आणि मल्टीप्लेक्स पीसीआर शोध जसे की SNP टायपिंग विश्लेषण करण्यासाठी वापरले जात असल्यास, फ्लोरोसेंट प्रोब पद्धत अपूरणीय आहे.
इतर रिअल टाइम पीसीआर प्रयोगांसाठी, एक साधी, सोपी आणि कमी किमतीची फ्लोरोसेंट चिमेरा पद्धत वापरली जाऊ शकते.

तपासणी मजबूत विशिष्टता, मल्टीप्लेक्स पीसीआर सक्षम

उणीव

प्रवर्धनासाठी उच्च विशिष्टता आवश्यकता;

मल्टीप्लेक्स पीसीआर केले जाऊ शकत नाही विशिष्ट प्रोब डिझाइन करणे आवश्यक आहे, उच्च किंमत;

कधीकधी प्रोब डिझाइन कठीण असते

संबंधित उत्पादने: