पारंपारिक रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस उच्च तापमान सहन करू शकत नाहीत (MMLV क्रियाकलापासाठी इष्टतम तापमान 37-50°C आहे आणि AMV 42-60°C आहे).अधिक जटिल व्हायरल RNA कमी तापमानात cDNA मध्ये प्रभावीपणे लिप्यंतरण केले जाऊ शकत नाही, परिणामी शोध कार्यक्षमता कमी होते.पारंपारिक RT-qPCR ला साधारणपणे दोन प्रमुख एन्झाइम्स (रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस आणि डीएनए पॉलिमरेझ) च्या सहभागाची आवश्यकता असते, ज्यामुळे प्रतिक्रिया प्रणालीचे ऑपरेशन सुलभ करणे आणि खर्च कमी करणे अशक्य होते.येथे आपण दोन उच्च-तापमान-प्रतिरोधक रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस, TtH आणि RevTaq सादर करू.या दोन एन्झाईममध्ये डीएनए पॉलिमरेझचे कार्य देखील आहे, म्हणून त्यांना द्विफंक्शनल एन्झाईम म्हणतात.

TtH DNA पॉलिमरेज

थर्मोफिलिक बॅक्टेरियम थर्मस थर्मोफिलस HB8 पासून प्राप्त झालेल्या TtH बद्दल तुम्ही ऐकले असेलच.Mg2+ सारख्या divalent cations च्या उपस्थितीत, त्यात DNA पॉलिमरेज क्रियाकलाप आहे.हे Taq एन्झाइम सारख्या PCR प्रतिक्रियांमध्ये मोठ्या प्रमाणावर वापरले जाते, परंतु ते Taq एन्झाइमपेक्षा जास्त उष्णता प्रतिरोधक आहे, त्यामुळे उच्च GC सामग्री टेम्पलेट्ससह PCR वर देखील त्याचा चांगला प्रभाव पडतो.

· या एंझाइममध्ये मुळात 3′→5′ exonuclease क्रियाकलाप आणि 5′→3′ exonuclease क्रियाकलाप नसतात, त्यामुळे ते डिडिओक्सी अनुक्रमासाठी देखील वापरले जाऊ शकते.

· या एन्झाइममध्ये RTase क्रिया असते.Mn2+ च्या उपस्थितीत, RTase क्रियाकलाप वर्धित केला जाईल.या वैशिष्ट्याचा वापर करून, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन रिअॅक्शन आणि पीसीआर रिअॅक्शन एकाच ट्यूबमध्ये, म्हणजेच वन-स्टेप आरटी-पीसीआर करण्यासाठी वापरला जाऊ शकतो.तथापि, Mn2+ च्या उपस्थितीत, RT-PCR ची अचूकता जास्त नाही.RT क्रियाकलापाचा rnaase H क्रियाकलापाशी काहीही संबंध नाही.

· Tth-DNA पॉलिमरेझची वाढलेली क्रिया (pH9, इष्टतम +55℃～+70℃, कमाल +95℃) RNA दुय्यम संरचनेमुळे उद्भवणाऱ्या समस्यांवर मात करते.परिणामी cDNA PCR द्वारे Mg2+ आयनच्या उपस्थितीत समान एन्झाइमसह वाढवता येते.

· उच्च तापमानात रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन आणि डीएनए एम्प्लिफिकेशन करण्याची Tth-DNA पॉलिमरेझची क्षमता हे एंझाइम सेल्युलर आणि व्हायरल आरएनएच्या परिमाणात्मक RT-PCR, क्लोनिंग आणि जनुक अभिव्यक्ती विश्लेषणासाठी उपयुक्त बनवते.
RNA 1kb पर्यंत वाढवण्यासाठी RT-PCR साठी Tth-DNA पॉलिमरेजचा वापर केला जातो.

वैशिष्ट्ये आणि फायदे

Tth DNA पॉलिमरेज:

• ऑप्टिमाइझ्ड पॉलिमरेझ चेन रिएक्शन (पीसीआर) उत्पादनाचा आकार, आरटी-पीसीआर प्रतिक्रियेमध्ये किमान 1000 बीपी असल्याची खात्री करा.

• सुधारित डीऑक्सीरिबोन्यूक्लिओसाइड ट्रायफॉस्फेट सब्सट्रेट म्हणून स्वीकारा

• RNase H क्रियाकलापाशी संबंधित नाही

• समस्यांवर मात करण्यासाठी उच्च थर्मल स्थिरता आहे, सामान्यत: RNA मध्ये उपस्थित असलेल्या उच्च माध्यमिक संरचनेशी संबंधित आहे

RevTaq RT-PCR DNA पॉलिमरेज

रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस अॅक्टिव्हिटीसह उष्णता-प्रतिरोधक डीएनए पॉलिमरेझ

RevTaq-RT-PCR-DNA पॉलिमरेझ एक अभियंता, उच्च उष्णता-प्रतिरोधक, दुहेरी-कार्यक्षम एन्झाइम आहे ज्यामध्ये रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस आणि डीएनए पॉलिमरेझ क्रियाकलाप निर्देशित आणि कृत्रिम उत्क्रांतीद्वारे प्राप्त होतात.

· RevTaq RT-PCR DNA पॉलिमरेझचे 95°C वर अर्धे आयुष्य 40 मिनिटांपेक्षा जास्त असते.

· RevTaq RT-PCR DNA पॉलिमरेझ उच्च-तापमान रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनला थेट RNA टेम्प्लेटमधून अनुमती देते आणि अधिक cDNA टेम्प्लेट तयार करण्यासाठी रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनची पायरी अनेक वेळा पुनरावृत्ती केली जाऊ शकते.

· RevTaq RT-PCR DNA पॉलिमरेझ "शून्य-चरण" RT-PCR (कोणतीही समथर्मल रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन स्टेप नाही) ला अनुमती देते, कारण चक्रीय पीसीआर विस्तार चरणात, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन आणि डीएनए प्रवर्धन एकाच वेळी होते.हे उच्च तापमानात रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन रिअॅक्शनला देखील प्रोत्साहन देते, ज्यामुळे उच्च तापमानात RNA मधील मजबूत दुय्यम संरचना वितळण्यात येणाऱ्या समस्या कमी होतात.

· ऍप्टॅमर-आधारित हॉट-स्टार्ट फॉर्म्युलामुळे, रेव्हटॅक आरटी-पीसीआर डीएनए पॉलिमरेझ अॅनिलिंग आणि एक्स्टेंशन तापमान 57°C पेक्षा जास्त असल्यास चांगले परिणाम देईल.

· एंझाइम उष्णता-प्रतिरोधक असल्याने, प्राइमर आणि प्रोबची रचना अत्यंत उच्च वितळण्याच्या बिंदूंसह (>60°C) करण्याची शिफारस केली जाते.

· प्रतिक्रिया सेटअप प्रक्रियेदरम्यान तापमान ग्रेडियंटद्वारे अॅनिलिंग/विस्तार चरणाचे तापमान ऑप्टिमाइझ करण्याची शिफारस केली जाते.

· तापमान जितके जास्त तितकी पीसीआरची विशिष्टता जास्त.रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन सायकल सामान्यतः पीसीआर सायकलपेक्षा जास्त तापमानात केली जाते, कारण डीएनए प्राइमर:आरएनए टेम्पलेट हायब्रिडायझेशनमध्ये सामान्यतः डीएनए प्राइमर:सीडीएनए टेम्पलेट डुप्लेक्सपेक्षा जास्त वितळण्याचा बिंदू असतो.

· RevTaq RT-PCR DNA पॉलिमरेझ अनुवांशिकरित्या इंजिनिअर केलेले आणि ऑप्टिमाइझ केलेले आहे आणि अॅम्प्लिकॉन आकार 60-300 bp दरम्यान आहे.

RevTaq RT-PCR DNA पॉलिमरेझ शोध मर्यादा 4 प्रतींवर पोहोचते/

ऑप्टिमाइझ केलेली प्रतिक्रिया प्रणाली (उच्च हळुवार बिंदू प्राइमर्सची स्थापना) आकृतीमध्ये दर्शविली आहे.RevTaq RT-PCR DNA पॉलिमरेझ-चालित RT-PCR TaqPath 1-स्टेप RT-qPCR मास्टर मिक्स आणि लोअर डिटेक्शन सॅम्पल डायल्युशन ग्रेडियंटपेक्षा चांगली संवेदनशीलता दाखवते.

अधिक फायदे:

क्विक स्टार्ट फंक्शन → प्रारंभिक थर्मल डिनेच्युरेशन पायरी वगळली जाऊ शकते.

हॉट-स्टार्ट ऍप्टॅमर फॉर्म्युला → 100% एंजाइम क्रियाकलाप त्वरित प्रदान करा आणि कमी तापमानात (<57°C) गैर-विशिष्ट प्रवर्धन टाळा.

क्लीव्हेज फंक्शन → RNA काढण्याची पायरी वगळली आहे, कारण RevTaq RT-PCR DNA पॉलिमरेझ क्रूड रिअॅक्शन नमुन्यांची प्रक्रिया देखील करू शकते.हे गरम RT-PCR चक्रात युकेरियोट्स, बॅक्टेरिया आणि विषाणूंचे पेशी पडदा त्वरित नष्ट करू शकते.

IVD कच्च्या मालाची पातळी → उच्च दर्जाची मानके आणि अत्यंत स्पर्धात्मक किमती