प्रयोगशाळेत नवीन म्हणून, कमी रूपांतरण दर असलेल्या वनस्पतींच्या गुच्छातून सकारात्मक रोपे तपासणे चांगले काम नाही.प्रथम, मोठ्या संख्येने नमुन्यांमधून एक एक करून डीएनए काढणे आवश्यक आहे आणि नंतर पीसीआरद्वारे परदेशी जनुकांचा शोध घेतला जाईल.तथापि, परिणाम अनेकदा रिक्त आणि अधूनमधून काही आयटमसह बँड असतात, परंतु चुकलेले डिटेक्शन किंवा खोटे शोध आहेत हे निर्धारित करणे अशक्य आहे..अशा प्रायोगिक प्रक्रिया आणि परिणामांना सामोरे जाणे फारच लाचार आहे का?काळजी करू नका, भाऊ तुम्हाला ट्रान्सजेनिक पॉझिटिव्ह रोपट्यांची सहज आणि अचूक तपासणी कशी करायची हे शिकवतो.

1 ली पायरी

डिझाइन डिटेक्शन प्राइमर्स

चाचणी करावयाच्या नमुन्यानुसार अंतर्जात जीन आणि एक्सोजेनस जीन शोधून काढा आणि प्राइमर डिझाइनसाठी जनुकातील प्रतिनिधी 100-500bp अनुक्रम निवडा.चांगले प्राइमर्स शोध परिणामांची अचूकता सुनिश्चित करू शकतात आणि शोध वेळ कमी करू शकतात (सामान्यतः वापरल्या जाणार्‍या डिटेक्शन प्राइमर्ससाठी परिशिष्ट पहा).

सूचना:नवीन डिझाईन केलेल्या प्राइमर्सना प्रतिक्रियेची परिस्थिती अनुकूल करणे आवश्यक आहे आणि मोठ्या प्रमाणात शोधण्यापूर्वी शोधाची अचूकता, अचूकता आणि शोध मर्यादा सत्यापित करणे आवश्यक आहे.

पायरी 2

प्रायोगिक प्रोटोकॉल डिझाइन करा

सकारात्मक नियंत्रण: PCR प्रतिक्रिया प्रणाली आणि परिस्थिती सामान्य आहेत की नाही हे निर्धारित करण्यासाठी टेम्प्लेट म्हणून लक्ष्य तुकडा असलेले शुद्ध केलेले डीएनए वापरा.

नकारात्मक/रिक्त नियंत्रण: PCR प्रणालीमध्ये दूषिततेचा स्रोत आहे की नाही हे शोधण्यासाठी टेम्प्लेट म्हणून लक्ष्य तुकडा नसलेला DNA टेम्पलेट किंवा ddH2O वापरा.

अंतर्गत संदर्भ नियंत्रण: नमुन्याच्या अंतर्जात जनुकाचे प्राइमर/प्रोब संयोजन वापरा आणि पीसीआरद्वारे टेम्पलेट शोधले जाऊ शकते की नाही हे तपासण्यासाठी चाचणी करा.

सूचना:

प्रायोगिक परिणामांच्या वैधतेचे मूल्यमापन करण्यासाठी प्रत्येक चाचणीसाठी सकारात्मक, नकारात्मक/रिक्त नियंत्रणे आणि अंतर्गत नियंत्रण नियंत्रणे सेट केली जावीत.

प्रयोगाची तयारी

वापरण्यापूर्वी, द्रावण समान प्रमाणात मिसळले आहे की नाही ते पहा.पर्जन्य आढळल्यास, वापरण्यापूर्वी ते विरघळणे आणि निर्देशांनुसार मिसळणे आवश्यक आहे.2×PCR मिक्स असमान आयन वितरण टाळण्यासाठी वापरण्यापूर्वी पाईपेट करणे आणि मायक्रोपिपेटमध्ये वारंवार मिसळणे आवश्यक आहे.

सूचना:

मॅन्युअल काढा आणि काळजीपूर्वक वाचा आणि मॅन्युअलच्या आवश्यकतांनुसार काटेकोरपणे प्रयोगापूर्वी तयारी करा.

पायरी 4

पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली तयार करा

प्रायोगिक प्रोटोकॉलनुसार, प्राइमर्स, H2O आणि 2×PCR मिक्स समान रीतीने मिसळा, सेंट्रीफ्यूज करा आणि प्रत्येक प्रतिक्रिया ट्यूबमध्ये वितरित करा.

सूचना:

मोठ्या प्रमाणात किंवा दीर्घकालीन चाचणीसाठी, UNG एन्झाइम असलेली PCR प्रतिक्रिया प्रणाली वापरण्याची शिफारस केली जाते, जी PCR उत्पादनांमुळे होणारे एरोसोल दूषित प्रभावीपणे टाळू शकते.

पायरी 5

प्रतिक्रिया टेम्पलेट जोडा

डायरेक्ट पीसीआर तंत्रज्ञानाचा वापर करून, कंटाळवाणा न्यूक्लिक अॅसिड शुद्धीकरण प्रक्रियेची गरज नाही, नमुना टेम्पलेट 10 मिनिटांत तयार केला जाऊ शकतो आणि संबंधित पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली जोडली जाऊ शकते.

सूचना:

क्लीव्हेज पद्धतीचा शोध घेण्याचा चांगला प्रभाव असतो आणि प्राप्त झालेले उत्पादन एकाधिक शोध प्रतिक्रियांसाठी वापरले जाऊ शकते.

5.1: पानांचा थेट विस्तार

मॅन्युअलमधील चित्राच्या आकारानुसार, 2-3 मिमी व्यासासह पानांचे ऊतक कापून पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणालीमध्ये ठेवा.

टीप: पानांचे तुकडे पीसीआर रिअॅक्शन सोल्युशनमध्ये पूर्णपणे बुडलेले आहेत याची खात्री करा आणि जास्त पानांचे ऊती जोडू नका.

5.2: लीफ स्प्लिट पद्धत

पानांची ऊती 5-7 मिमी व्यासासह कापून सेंट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये ठेवा.जर तुम्ही परिपक्व पाने निवडत असाल, तर कृपया पानाच्या मुख्य शिरेच्या ऊतींचा वापर टाळा.पिपेट 50ul बफर P1 लाइसेट एका सेंट्रीफ्यूज ट्यूबमध्ये लायसेट पूर्णपणे पानांच्या ऊतींचे विसर्जन करू शकते, ते थर्मल सायकलर किंवा मेटल बाथमध्ये ठेवा आणि 5-10 मिनिटांसाठी 95° सेल्सिअसवर लाइसेट करा.

50ul Buffer P2 न्यूट्रलायझेशन सोल्यूशन घाला आणि चांगले मिसळा.परिणामी लाइसेटचा वापर टेम्पलेट म्हणून केला जाऊ शकतो आणि पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणालीमध्ये जोडला जाऊ शकतो.

टीप: टेम्प्लेटचे प्रमाण पीसीआर प्रणालीच्या 5-10% च्या दरम्यान आहे आणि ते 20% पेक्षा जास्त नसावे (उदाहरणार्थ, 20μl पीसीआर प्रणालीमध्ये, 1-2μl लिसिस सोल्यूशन जोडा, 4μl पेक्षा जास्त नाही).

पायरी 6

पीसीआर प्रतिक्रिया

पीसीआर रिअॅक्शन ट्यूबला सेंट्रीफ्यूज केल्यानंतर, ते प्रवर्धनासाठी पीसीआर इन्स्ट्रुमेंटमध्ये ठेवले जाते.

सूचना:

अभिक्रिया प्रवर्धनासाठी नॉन-प्युरिफाईड टेम्प्लेट वापरते, म्हणून प्रवर्धन चक्रांची संख्या शुद्ध डीएनए टेम्पलेट वापरण्यापेक्षा 5-10 अधिक चक्र असते.

पायरी 7

इलेक्ट्रोफोरेसीस शोध आणि परिणाम विश्लेषण

M: 100bp DNA शिडी

1\4: शुद्ध DNA पद्धत

2\5: थेट पीसीआर पद्धत

3\6: रिक्त नियंत्रण

QC:

प्रयोगात सेट केलेल्या विविध नियंत्रणांच्या चाचणी परिणामांनी खालील अटी पूर्ण केल्या पाहिजेत.अन्यथा, समस्येच्या कारणाचे विश्लेषण केले पाहिजे आणि समस्या दूर झाल्यानंतर पुन्हा चाचणी केली पाहिजे.

तक्ता 1. विविध नियंत्रण गटांचे सामान्य चाचणी परिणाम

*जेव्हा प्लास्मिडचा उपयोग सकारात्मक नियंत्रण म्हणून केला जातो, तेव्हा अंतर्जात जनुक चाचणीचा परिणाम नकारात्मक असू शकतो

निकालाचा निकाल:

A. नमुन्याच्या अंतर्जात जनुकाच्या चाचणीचा परिणाम नकारात्मक आहे, जे दर्शविते की सामान्य PCR शोधण्यासाठी योग्य DNA नमुन्यातून काढता येत नाही किंवा काढलेल्या DNA मध्ये PCR प्रतिक्रिया अवरोधक असतात आणि DNA पुन्हा काढला जावा.

B. नमुन्याच्या अंतर्जात जनुकाच्या चाचणीचा परिणाम सकारात्मक आहे, आणि बाह्य जनुकाच्या चाचणीचा परिणाम नकारात्मक आहे, हे दर्शविते की सामान्य PCR शोधण्यासाठी योग्य DNA नमुन्यातून काढला गेला आहे, आणि नमुन्यामध्ये XXX जनुक आढळले नाही असे ठरवले जाऊ शकते.

C. नमुन्याच्या अंतर्जात जनुकाच्या चाचणीचा परिणाम सकारात्मक आहे, आणि बाह्य जनुकाच्या चाचणीचा परिणाम सकारात्मक आहे, हे दर्शविते की सामान्य PCR शोधण्यासाठी योग्य DNA नमुन्यातून काढला गेला आहे आणि नमुना DNA मध्ये XXX जनुक आहे.पुष्टीकरणाचे प्रयोग पुढे केले जाऊ शकतात.

पायरी 8

डिझाइन डिटेक्शन प्राइमर्स

प्रयोगानंतर, पर्यावरणाचे प्रदूषण रोखण्यासाठी प्रायोगिक क्षेत्र पुसण्यासाठी 2% सोडियम हायपोक्लोराईट द्रावण आणि 70% इथेनॉल द्रावण वापरा.