पीसीआर हे सर्वात मोठ्या प्रमाणावर वापरले जाणारे न्यूक्लिक अॅसिड अॅम्प्लिफिकेशन तंत्रज्ञान आहे आणि त्याची संवेदनशीलता आणि विशिष्टतेमुळे मोठ्या प्रमाणावर वापरले जाते.तथापि, पीसीआरला वारंवार थर्मल डिनेच्युरेशनची आवश्यकता असते आणि उपकरणे आणि उपकरणांवर अवलंबून राहण्याच्या मर्यादांपासून मुक्त होऊ शकत नाही, ज्यामुळे त्याचा उपयोग क्लिनिकल फील्ड चाचणीमध्ये मर्यादित होतो.

1990 च्या दशकाच्या सुरुवातीपासून, बर्‍याच प्रयोगशाळांनी स्थिर तापमान प्रवर्धन तंत्रज्ञान विकसित करण्यास सुरुवात केली आहे ज्यास थर्मल विकृतीची आवश्यकता नाही.आता त्यांनी लूप-मीडिएटेड आयसोथर्मल अॅम्प्लिफिकेशन तंत्रज्ञान, स्ट्रँड रिप्लेसमेंट आइसोथर्मल अॅम्प्लीफिकेशन तंत्रज्ञान, रोलिंग सर्कल आइसोथर्मल अॅम्प्लिफिकेशन तंत्रज्ञान आणि न्यूक्लिक अॅसिड सीक्वेन्स डिपेंडन्स विकसित केले आहे.आइसोथर्मल प्रवर्धन तंत्रज्ञान आणि इतर तंत्रज्ञान. 

Loop-मध्यस्थ समतापीय प्रवर्धन

एम्प्लीफिकेशन तत्त्व हे वस्तुस्थितीवर आधारित आहे की डीएनए डायनॅमिक समतोल स्थितीत सुमारे 65°C वर आहे.जेव्हा कोणताही प्राइमर बेस-पेअर केलेला असतो आणि दुहेरी-असरलेल्या DNA च्या पूरक भागापर्यंत वाढवला जातो, तेव्हा दुसरा स्ट्रँड विलग होतो आणि एकल-स्ट्रँडेड होतो.

या तापमानात, DNA स्ट्रँड-डिस्प्लेसमेंट DNA पॉलिमरेझवर अवलंबून राहण्यासाठी 4 विशिष्ट प्राइमर्स वापरतो ज्यामुळे स्ट्रँड-डिस्प्लेसमेंट DNA चे संश्लेषण सतत स्वयं-अभिसरण होते.

प्रथम लक्ष्य जनुकावर 6 विशिष्ट प्रदेश F3, F2, F1, B1, B2, B3 निश्चित करा आणि नंतर या 6 विशिष्ट प्रदेशांवर आधारित 4 प्राइमर्स डिझाइन करा (खालील आकृतीत दर्शविल्याप्रमाणे):

फॉरवर्ड इनर प्राइमर (FIP) F1c आणि F2 ने बनलेला आहे.

बॅकवर्ड इनर प्राइमर (BIP) B1c आणि B2 ने बनलेला आहे आणि TTTT मध्यभागी स्पेसर म्हणून वापरला जातो.

बाह्य प्राइमर्स F3 आणि B3 अनुक्रमे लक्ष्य जनुकावरील F3 आणि B3 क्षेत्रांनी बनलेले आहेत.

LAMP प्रतिक्रिया प्रणालीमध्ये, आतील प्राइमरची एकाग्रता बाह्य प्राइमरच्या अनेक पट असते.डीएनए डबल स्ट्रँड तयार करण्यासाठी पूरक स्ट्रँडचे संश्लेषण करण्यासाठी आतील प्राइमर प्रथम टेम्प्लेट स्ट्रँडसह एकत्र केला जातो.त्यानंतर, बाह्य प्राइमर टेम्प्लेट स्ट्रँडसह एकत्र केला जातो ज्यामुळे DNA दुहेरी स्ट्रँड तयार होतो.BstDNA पॉलिमरेजच्या कृती अंतर्गत, आतील प्राइमरद्वारे संश्लेषित पूरक स्ट्रँड सोडला जातो.प्रतिक्रियांच्या मालिकेनंतर, पूरक स्ट्रँड शेवटी डंबेल रचनेसह एकच DNA स्ट्रँड बनवते.

डंबेल स्ट्रक्चर डीएनए सिंगल स्ट्रँडचा वापर खुल्या टोकासह सतत संक्रमणकालीन स्टेम-लूप स्ट्रक्चर डीएनए तयार करण्यासाठी टेम्पलेट म्हणून केला जातो.आतील आणि बाहेरील प्राइमर्स ट्रान्सिशनल स्टेम-लूप स्ट्रक्चर DNA ला सतत स्ट्रँड डिस्प्लेसमेंट आणि एक्स्टेंशन रिअॅक्शन्समधून जाण्यासाठी मार्गदर्शन करतात आणि शेवटी वेगवेगळ्या लांबीच्या अनेक स्टेम-लूप स्ट्रक्चर्स तयार करतात.डीएनए मिश्रण.

लूप-मध्यस्थ समतापीय प्रवर्धनाचे फायदे आणि तोटे

LAMP चे फायदे:

(1) उच्च प्रवर्धन कार्यक्षमता, जी 1 तासाच्या आत लक्ष्य जनुकाच्या 1-10 प्रती प्रभावीपणे वाढवू शकते आणि प्रवर्धन कार्यक्षमता सामान्य पीसीआरच्या 10-100 पट आहे.

(2) प्रतिक्रिया वेळ लहान आहे, विशिष्टता मजबूत आहे, आणि विशेष उपकरणे आवश्यक नाही.

LAMP च्या कमतरता:

(1) प्राइमर्सची आवश्यकता विशेषतः जास्त आहे.

(2) प्रवर्धित उत्पादनाचा वापर क्लोनिंग आणि अनुक्रमासाठी केला जाऊ शकत नाही, परंतु केवळ निर्णयासाठी वापरला जाऊ शकतो.

(3) त्याच्या तीव्र संवेदनशीलतेमुळे, एरोसोल तयार करणे सोपे आहे, ज्यामुळे खोटे सकारात्मक परिणाम होतात आणि चाचणी परिणामांवर परिणाम होतो.

Sट्रँड विस्थापन प्रवर्धन

स्ट्रँड डिस्प्लेसमेंट अॅम्प्लीफिकेशन (एसडीए) हे 1992 मध्ये अमेरिकन विद्वान वॉकर यांनी प्रथम प्रस्तावित केलेल्या एन्झाईमॅटिक प्रतिक्रियेवर आधारित इन विट्रो आइसोथर्मल डीएनए प्रवर्धन तंत्र आहे.

SDA च्या मूलभूत प्रणालीमध्ये निर्बंध एंडोन्यूक्लिझ, स्ट्रँड डिस्प्लेसमेंट ऍक्टिव्हिटीसह DNA पॉलिमरेज, दोन जोड्या प्राइमर्स, dNTPs आणि कॅल्शियम आणि मॅग्नेशियम आयन आणि बफर सिस्टम समाविष्ट आहेत.

स्ट्रँड डिस्प्लेसमेंट अॅम्प्लीफिकेशनचे तत्त्व लक्ष्य डीएनएच्या दोन्ही टोकांवर रासायनिक सुधारित प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिझ ओळख अनुक्रमांवर आधारित आहे.एंडोन्यूक्लिझ स्ट्रँड डीएनएमधील अंतर त्याच्या ओळखीच्या ठिकाणी उघडते आणि डीएनए पॉलिमरेझ अंतर 3′ वाढवते आणि पुढील डीएनए स्ट्रँड बदलते.

डीएनएचे बदललेले सिंगल स्ट्रँड प्राइमर्ससह एकत्र केले जाऊ शकतात आणि डीएनए पॉलिमरेझद्वारे दुहेरी स्ट्रँडमध्ये विस्तारित केले जाऊ शकतात.ही प्रक्रिया सतत पुनरावृत्ती केली जाते, ज्यामुळे लक्ष्य क्रम कार्यक्षमतेने वाढविला जातो.

स्ट्रँड विस्थापन प्रवर्धन तंत्रज्ञानाचे फायदे आणि तोटे

SDA चे फायदे:

प्रवर्धन कार्यक्षमता जास्त आहे, प्रतिक्रिया वेळ कमी आहे, विशिष्टता मजबूत आहे आणि कोणत्याही विशेष उपकरणांची आवश्यकता नाही.

SDA च्या उणीवा:

उत्पादने एकसमान नसतात, आणि काही सिंगल-स्ट्रँडेड आणि डबल-स्ट्रँडेड उत्पादने नेहमी SDA सायकलमध्ये तयार केली जातात आणि इलेक्ट्रोफोरेसीसद्वारे आढळल्यास शेपटी अपरिहार्यपणे घडते.

Rolling वर्तुळ प्रवर्धन

रोलिंग सर्कल अॅम्प्लीफिकेशन (RCA) हे सर्कल रोलिंगद्वारे रोगजनक जीवांपासून डीएनए कॉपी करण्याच्या पद्धतीवर रेखांकन करून प्रस्तावित आहे.हे एका स्थिर तापमानात टेम्प्लेट म्हणून सिंगल-स्ट्रँडेड वर्तुळाकार डीएनएचा वापर आणि लक्ष्य जनुकाचे प्रवर्धन साध्य करण्यासाठी रोलिंग सर्कल डीएनए संश्लेषणाच्या कृती अंतर्गत विशेष डीएनए पॉलिमरेझ (जसे की Phi29) वापरणे संदर्भित करते.

RCA ला रेखीय प्रवर्धन आणि घातांकीय प्रवर्धन मध्ये विभागले जाऊ शकते.रेखीय आरसीएची कार्यक्षमता 10 पर्यंत पोहोचू शकते⁵वेळा, आणि घातांक RCA ची कार्यक्षमता 10 पर्यंत पोहोचू शकते⁹वेळा

खालील आकृतीत दाखवल्याप्रमाणे साधा फरक, रेखीय प्रवर्धन a मध्ये फक्त 1 प्राइमर वापरतो, घातांक प्रवर्धन b मध्ये 2 प्राइमर्स आहेत.

रेखीय RCA ला सिंगल प्राइमर RCA देखील म्हणतात.प्राइमर वर्तुळाकार DNA ला बांधला जातो आणि DNA पॉलिमरेझच्या क्रियेने वाढवला जातो.उत्पादन एक रेषीय सिंगल स्ट्रँड आहे ज्यामध्ये एका लूपच्या लांबीच्या हजारो पट जास्त पुनरावृत्ती अनुक्रम आहेत.

रेखीय RCA चे उत्पादन नेहमी सुरुवातीच्या प्राइमरशी जोडलेले असल्याने, सिग्नलचे सुलभ निर्धारण हा एक मोठा फायदा आहे.

एक्सपोनेन्शिअल आरसीए, ज्याला हायपर ब्रँच्ड अॅम्प्लीफिकेशन एचआरसीए (हायपर ब्रँच्ड आरसीए) म्हणूनही ओळखले जाते, एक्सपोनेन्शियल आरसीएमध्ये, एक प्राइमर RCA उत्पादन वाढवतो, दुसरा प्राइमर RCA उत्पादनासह संकरित होतो आणि विस्तारित करतो आणि रिप्लेसमेंट आधीच RCA उत्पादनास बांधील आहे, डाउनस्ट्रीम प्राइमर्स स्ट्रँडचा विस्तार करतात आणि RCA रिप्लेसमेंट रिप्लेसमेंट एएमपीएल उत्पादन वाढवतात.

रोलिंग सर्कल न्यूक्लिक अॅसिड अॅम्प्लिफिकेशनचे फायदे आणि तोटे

RCA चे फायदे:

उच्च संवेदनशीलता, चांगली विशिष्टता आणि सोपे ऑपरेशन.

RCA च्या उणीवा:

सिग्नल डिटेक्शन दरम्यान पार्श्वभूमी समस्या.आरसीए प्रतिक्रियेदरम्यान, अनियंत्रित पॅडलॉक प्रोब आणि अनबाउंड प्रोबचे टेम्पलेट डीएनए किंवा आरएनए काही पार्श्वभूमी सिग्नल तयार करू शकतात. 

Nucleicacid अनुक्रम-आधारित प्रवर्धन

न्यूक्लिक अॅसिड सिक्वेन्स-बेस्ड अॅम्प्लिफिकेशन (NASBA) हे पीसीआरच्या आधारे विकसित केलेले नवीन तंत्रज्ञान आहे.हे T7 प्रमोटर अनुक्रमासह प्राइमर्सच्या जोडीद्वारे मार्गदर्शन केलेले एक सतत आणि समतापीय न्यूक्लिक अॅसिड अॅम्प्लिफिकेशन आहे.तंत्रज्ञान सुमारे 2 तासात टेम्पलेट RNA 109 पट वाढवू शकते, जे पारंपारिक पीसीआर पद्धतीपेक्षा 1000 पट जास्त आहे आणि त्यासाठी विशेष उपकरणांची आवश्यकता नाही.

हे तंत्रज्ञान दिसल्याबरोबर रोगांचे जलद निदान करण्यासाठी वापरले गेले आहे आणि सध्या अनेक कंपन्या ही पद्धत आरएनए डिटेक्शन किटमध्ये वापरतात.

जरी RNA प्रवर्धक रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन पीसीआर तंत्रज्ञानाचा वापर करू शकते, तरी NASBA चे स्वतःचे फायदे आहेत: ते तुलनेने स्थिर तापमान परिस्थितीत केले जाऊ शकते आणि ते पारंपारिक पीसीआर तंत्रज्ञानापेक्षा अधिक स्थिर आणि अचूक आहे.

प्रतिक्रिया 41 अंश सेल्सिअस आहे आणि पूर्ण करण्यासाठी AMV (एव्हियन मायलोब्लास्टोसिस व्हायरस) रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस, RNase H, T7 RNA पॉलिमरेझ आणि प्राइमर्सची एक जोडी आवश्यक आहे.

प्रक्रियेमध्ये प्रामुख्याने समाविष्ट आहे:

फॉरवर्ड प्राइमरमध्ये T7 प्रमोटरचा पूरक क्रम असतो.प्रतिक्रियेदरम्यान, फॉरवर्ड प्राइमर RNA स्ट्रँडला जोडतो आणि AMV एन्झाइमद्वारे उत्प्रेरित होऊन DNA-RNA दुहेरी स्ट्रँड तयार होतो.

RNase H संकरित डबल-स्ट्रँडमध्ये RNA पचवतो आणि एकल-स्ट्रँडेड DNA राखून ठेवतो.

रिव्हर्स प्राइमर आणि एएमव्ही एंझाइमच्या कृती अंतर्गत, T7 प्रमोटर अनुक्रम असलेले DNA दुहेरी स्ट्रँड तयार होतो.

T7 RNA पॉलिमरेझच्या कृती अंतर्गत, प्रतिलेखन प्रक्रिया पूर्ण होते आणि मोठ्या प्रमाणात लक्ष्यित RNA तयार होते.

NASBA चे फायदे:

(1) याच्या प्राइमरमध्ये T7 प्रवर्तक अनुक्रम आहे, परंतु विदेशी दुहेरी-स्ट्रँडेड DNA मध्ये T7 प्रवर्तक अनुक्रम नाही आणि ते वाढवले ​​जाऊ शकत नाही, म्हणून या तंत्रज्ञानामध्ये उच्च विशिष्टता आणि संवेदनशीलता आहे.

(2) NASBA थेट प्रवर्धक अभिक्रियामध्ये रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन प्रक्रिया समाविष्ट करते, प्रतिक्रिया वेळ कमी करते.

NASBA चे तोटे:

(1) प्रतिक्रिया घटक अधिक क्लिष्ट आहेत.

(२) प्रतिक्रियेची किंमत जास्त करण्यासाठी तीन प्रकारच्या एन्झाईम्सची आवश्यकता असते.