फ्लोरोसेन्स क्वांटिटेटिव्ह पीसीआर (ज्याला TaqMan PCR असेही म्हणतात, यापुढे FQ-PCR म्हणून ओळखले जाते) हे PE (पर्किन एल्मर) यांनी 1995 मध्ये युनायटेड स्टेट्समध्ये विकसित केलेले नवीन न्यूक्लिक अॅसिड परिमाणात्मक तंत्रज्ञान आहे. हे तंत्रज्ञान फ्लोरोसेंट लेबल केलेले प्रोब जोडून पारंपारिक पीसीआरवर आधारित आहे.लवचिक पीसीआरच्या तुलनेत, एफक्यू-पीसीआरचे परिमाणात्मक कार्य लक्षात येण्यासाठी अनेक फायदे आहेत.हा लेख तंत्रज्ञानाची वैशिष्ट्ये, तत्त्वे, पद्धती आणि अनुप्रयोगांचे थोडक्यात वर्णन करण्याचा हेतू आहे.

1 वैशिष्ट्ये

FQ-PCR मध्ये केवळ सामान्य PCR ची उच्च संवेदनशीलता नाही, तर फ्लोरोसेंट प्रोबच्या वापरामुळे, PCR प्रवर्धनादरम्यान फ्लोरोसेंट सिग्नलचा बदल थेट परिमाणात्मक परिणाम प्राप्त करण्यासाठी फोटोइलेक्ट्रिक वहन प्रणालीद्वारे शोधू शकतो, ज्यामुळे पारंपारिक पीसीआरच्या अनेक उणीवांवर मात केली जाते, त्यामुळे त्यात उच्च विशिष्टता आणि डीएनए विशिष्ट तंत्रज्ञानाची विशिष्टता आहे.

उदाहरणार्थ, सामान्य पीसीआर उत्पादनांना अॅग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस आणि एथिडिअम ब्रोमाइड डाग अल्ट्राव्हायोलेट लाइटने किंवा पॉलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस आणि सिल्व्हर स्टेनिंगद्वारे पाहणे आवश्यक आहे.यासाठी केवळ अनेक उपकरणांची आवश्यकता नाही तर वेळ आणि मेहनत देखील आवश्यक आहे.इथिडियम ब्रोमाइड वापरलेले डाग मानवी शरीरासाठी हानिकारक आहेत आणि या क्लिष्ट प्रायोगिक प्रक्रियेमुळे प्रदूषण आणि खोट्या सकारात्मक गोष्टींना संधी मिळते.तथापि, FQ-PCR ला नमुना लोडिंग दरम्यान फक्त एकदाच झाकण उघडणे आवश्यक आहे, आणि त्यानंतरची प्रक्रिया पूर्णपणे बंद-ट्यूब ऑपरेशन आहे, ज्याला PCR पोस्ट-प्रोसेसिंगची आवश्यकता नाही, पारंपारिक पीसीआर ऑपरेशन्समधील अनेक कमतरता टाळतात.प्रयोगात साधारणपणे पीई कंपनीने विकसित केलेल्या ABI7100 PCR थर्मल सायकलरचा वापर केला जातो.

इन्स्ट्रुमेंटमध्ये खालील वैशिष्ट्ये आहेत: ① विस्तृत अनुप्रयोग: याचा वापर डीएनए आणि आरएनए पीसीआर उत्पादन प्रमाणीकरण, जनुक अभिव्यक्ती संशोधन, रोगजनक शोध आणि पीसीआर परिस्थितीचे ऑप्टिमायझेशन यासाठी केला जाऊ शकतो.② अद्वितीय परिमाणवाचक तत्त्व: फ्लोरोसेंटली लेबल केलेल्या प्रोबचा वापर करून, लेसर उत्तेजित झाल्यानंतर पीसीआर चक्रासोबत फ्लोरोसेन्सचे प्रमाण जमा होईल, जेणेकरून परिमाणीकरणाचा उद्देश साध्य होईल.③ उच्च कार्यक्षमता: अंगभूत 9600 PCR थर्मल सायकलर, 1 ते 2 तास नियंत्रित संगणक 96 नमुन्यांची प्रवर्धन आणि परिमाण स्वयंचलितपणे आणि समकालिकपणे पूर्ण करण्यासाठी.④ जेल इलेक्ट्रोफोरेसीसची आवश्यकता नाही: नमुना पातळ करण्याची आणि इलेक्ट्रोफोरेसीस करण्याची आवश्यकता नाही, फक्त प्रतिक्रिया ट्यूबमध्ये थेट शोधण्यासाठी विशेष प्रोब वापरा.⑤ पाइपलाइनमध्ये प्रदूषण नाही: अद्वितीय पूर्णपणे बंद प्रतिक्रिया ट्यूब आणि फोटोइलेक्ट्रिक वहन प्रणाली स्वीकारली गेली आहे, त्यामुळे प्रदूषणाबद्दल काळजी करण्याची गरज नाही.⑥परिणाम पुनरुत्पादक आहेत: परिमाणात्मक डायनॅमिक श्रेणी परिमाणाच्या पाच ऑर्डरपर्यंत आहे.म्हणून, हे तंत्रज्ञान यशस्वीरित्या विकसित झाल्यापासून, अनेक वैज्ञानिक संशोधकांनी ते मूल्यवान केले आहे आणि अनेक क्षेत्रांमध्ये लागू केले आहे.

2 तत्त्वे आणि पद्धती

FQ-PCR चे कार्य तत्त्व म्हणजे PCR प्रतिक्रिया प्रणालीमध्ये फ्लोरोसेंटली लेबल असलेली प्रोब जोडण्यासाठी Taq एन्झाइमची 5′→3′ एक्सोन्यूक्लीज क्रियाकलाप वापरणे.प्रोब विशेषत: प्राइमर अनुक्रमात असलेल्या डीएनए टेम्पलेटसह संकरित करू शकते.प्रोबच्या 5′शेवटला फ्लूरोसेन्स उत्सर्जन जनुक FAM (6-carboxyfluorescein, 518nm वर फ्लूरोसेन्स उत्सर्जन पीक) असे लेबल लावलेले आहे आणि 3′एंडला The fluorescence quenching group TAMRA (6-carboxytramethylrhodine 58nm), 5′अखेर फ्लूरोसेन्स क्वेंचिंग ग्रुपने लेबल केले आहे. पीसीआर एम्प्लीफिकेशन दरम्यान प्रोब वाढवण्यापासून रोखण्यासाठी प्रोबची सुरूवात फॉस्फोरिलेटेड आहे.जेव्हा प्रोब अखंड राहते, तेव्हा क्वेन्चर ग्रुप उत्सर्जित गटाचे फ्लूरोसेन्स उत्सर्जन दाबतो.उत्सर्जन गट शमन गटापासून विभक्त झाल्यानंतर, प्रतिबंध उठविला जातो, आणि 518nm वर ऑप्टिकल घनता वाढते आणि ती प्रतिदीप्ति शोध प्रणालीद्वारे शोधली जाते. पुनर्नवीनीकरण टप्प्यात, प्रोब टेम्प्लेट DNA सह संकरित होते आणि विस्ताराच्या प्राइम फेजमध्ये Taq एन्झाईम DNA सोबत विस्तारित होते.जेव्हा प्रोब कापला जातो, तेव्हा शमन प्रभाव सोडला जातो आणि फ्लोरोसेंट सिग्नल सोडला जातो.प्रत्येक वेळी टेम्प्लेट कॉपी केल्यावर, फ्लोरोसेंट सिग्नलच्या रिलीझसह एक प्रोब कापला जातो.प्रकाशीत फ्लोरोफोर्सची संख्या आणि पीसीआर उत्पादनांची संख्या यांच्यात एक ते एक संबंध असल्याने, हे तंत्र टेम्पलेट अचूकपणे मोजण्यासाठी वापरले जाऊ शकते.प्रायोगिक साधन साधारणपणे PE कंपनीने विकसित केलेले ABI7100 PCR थर्मल सायकलर वापरते आणि इतर थर्मल सायकलर देखील वापरता येतात.प्रयोगासाठी ABI7700 प्रतिक्रिया प्रकार प्रतिक्रिया प्रणाली वापरली असल्यास, प्रतिक्रिया पूर्ण झाल्यानंतर, संगणकीय विश्लेषणाद्वारे परिमाणवाचक परिणाम थेट दिले जाऊ शकतात.जर तुम्ही इतर थर्मल सायकलर्स वापरत असाल, तर तुम्हाला RQ+, RQ-, △RQ ची गणना करण्यासाठी एकाच वेळी रिअॅक्शन ट्यूबमधील फ्लूरोसेन्स सिग्नल मोजण्यासाठी फ्लोरोसेन्स डिटेक्टर वापरण्याची आवश्यकता आहे.RQ+ नमुना ट्यूबच्या फ्लूरोसंट उत्सर्जन गटाच्या ल्युमिनेसेन्स तीव्रतेचे आणि क्वेन्चिंग ग्रुपच्या ल्युमिनेसेन्स तीव्रतेचे गुणोत्तर दर्शविते, RQ- रिकाम्या नळीतील दोघांचे गुणोत्तर दर्शविते, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) दर्शविते, पीसीआर फ्लूच्या प्रक्रियेदरम्यान डेटाचे प्रमाण बदलू शकते. .फ्लोरोसेंट प्रोबच्या परिचयामुळे, प्रयोगाची विशिष्टता लक्षणीयरीत्या सुधारली आहे.प्रोब डिझाइनने साधारणपणे खालील अटी पूर्ण केल्या पाहिजेत: ①बाइंडिंगची विशिष्टता सुनिश्चित करण्यासाठी प्रोबची लांबी सुमारे 20-40 बेस असावी.②एकल न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमांची डुप्लिकेशन टाळण्यासाठी GC बेसची सामग्री 40% आणि 60% च्या दरम्यान आहे.③ संकरीकरण टाळा किंवा प्राइमरसह ओव्हरलॅप करा.④ प्रोब आणि टेम्प्लेटमधील बंधनाची स्थिरता ही प्राइमर आणि टेम्पलेटमधील बंधनाच्या स्थिरतेपेक्षा जास्त आहे, म्हणून प्रोबचे Tm मूल्य प्राइमरच्या Tm मूल्यापेक्षा किमान 5°C जास्त असावे.याशिवाय, प्रोबची एकाग्रता, प्रोब आणि टेम्प्लेट क्रम यांच्यातील समरूपता आणि प्रोब आणि प्राइमरमधील अंतर या सर्वांचा प्रायोगिक परिणामांवर परिणाम होतो.

संबंधित उत्पादने:

चायना Lnc-RT Heroᵀᴹ I(gDNase सह)(lncRNA कडून प्रथम-स्ट्रँड cDNA संश्लेषणासाठी सुपर प्रीमिक्स) निर्माता आणि पुरवठादार |Foregene (foreivd.com)

चीन रिअल टाइम पीसीआर Easyᵀᴹ-Takman निर्माता आणि पुरवठादार |Foregene (foreivd.com)