PCR अभिकर्मकांच्या सुरुवातीच्या टप्प्यात प्राइमर्स आणि प्रोब्सच्या कार्यक्षमतेची पडताळणी करणे आणि सर्वात योग्य प्रतिक्रिया परिस्थिती निश्चित करणे या औपचारिक प्रयोगांची सुरळीत प्रगती सुनिश्चित करण्यासाठी आवश्यक गोष्टी आहेत.
तर सुरुवातीच्या टप्प्यात प्राइमर प्रोबची पुष्टी कशी करायची?
मुख्य निर्देशक आहेत बेसलाइन, अॅम्प्लीफिकेशन वक्र, सीटी व्हॅल्यू, अॅम्प्लीफिकेशन कार्यक्षमता, कमी-सांद्रता नमुना शोध, सीव्ही इ.
बेसलाइन
बेसलाइन ही PCR प्रवर्धन वक्र मधील क्षैतिज रेषा आहे.पीसीआर प्रवर्धन प्रतिक्रियेच्या पहिल्या काही चक्रांमध्ये, फ्लोरोसेन्स सिग्नल फारसा बदलत नाही आणि एक सरळ रेषा बनवते.ही सरळ रेषा बेसलाइन आहे.
पीसीआर प्राइमर प्रोब तपासताना, बेसलाइन लेव्हल आहे की नाही याकडे लक्ष द्या.प्राइमर प्रोब एकाग्रतेची शुद्धता बेसलाइनवर परिणाम करेल, जसे की बेसलाइन वाढणे किंवा पडणे.बेसलाइन देखील एक अतिशय अंतर्ज्ञानी सूचक आहे.
प्रवर्धन वक्र
आणखी एक अंतर्ज्ञानी निर्देशक प्रवर्धन वक्र आकार आहे.दुय्यम प्रवर्धन किंवा इतर असामान्य प्रवर्धन वक्र टाळण्यासाठी एस-आकाराचे वक्र असणे चांगले.
Ct मूल्य
बेसलाइनपासून घातांकीय वाढीपर्यंतच्या वळण बिंदूशी संबंधित चक्रांची संख्या म्हणजे Ct मूल्य.
समान नमुन्यासाठी, भिन्न प्राइमर प्रोबचा परिणाम भिन्न प्रवर्धन वक्रांमध्ये होतो आणि संबंधित Ct मूल्य प्रवर्धन कार्यक्षमता आणि हस्तक्षेप अंशाने प्रभावित होईल.सिद्धांतानुसार, आम्ही निवडलेल्या प्राइमर प्रोबचे Ct मूल्य जितके लहान असेल तितके चांगले.
प्रवर्धन कार्यक्षमता
पीसीआर प्रवर्धन कार्यक्षमतेचे मूल्यांकन करण्यासाठी सर्वात विश्वासार्ह आणि स्थिर पद्धतींपैकी एक मानक वक्र आहे, ज्याला संशोधकांनी देखील व्यापकपणे ओळखले आहे.या पद्धतीमध्ये लक्ष्य टेम्पलेट्सची सापेक्ष संख्या नियंत्रित करण्यासाठी नमुन्यांची मालिका बनवणे समाविष्ट आहे.हे नमुने सामान्यत: एकाग्र केलेल्या स्टॉक सोल्यूशन्सच्या अनुक्रमिक डायल्युशनद्वारे तयार केले जातात, सर्वात सामान्यतः 10-पट डायल्युशन वापरले जाते.पातळ नमुन्यांची मालिका वापरून, Cq मूल्य प्राप्त करण्यासाठी विस्तृत करण्यासाठी मानक qPCR प्रोग्राम वापरून, आणि शेवटी प्रत्येक नमुन्याच्या एकाग्रतेनुसार मानक वक्र काढा आणि रेखीय समीकरण Cq= -klgX0+b, आणि प्रवर्धन कार्यक्षमता E=10(-1 /k1)- प्राप्त करण्यासाठी संबंधित Cq मूल्य.परिमाणात्मक विश्लेषणासाठी qPCR वापरताना, प्रवर्धन कार्यक्षमता 90%-110% (3.6>k>3.1) च्या श्रेणीत असणे आवश्यक आहे.
कमी एकाग्रता नमुने शोध
जेव्हा नमुना एकाग्रता कमी असते, तेव्हा वेगवेगळ्या प्राइमर प्रोबचे शोध दर भिन्न असतात.आम्ही प्रतिकृती तयार करण्यासाठी 20 कमी-एकाग्रतेचे नमुने निवडतो आणि सर्वोच्च शोध दर असलेली प्राइमर-प्रोब प्रणाली सर्वोत्तम आहे.
भिन्नतेचे गुणांक (CV)
न्यूक्लिक अॅसिड अॅम्प्लिफिकेशन डिटेक्शनसाठी अभिकर्मकाच्या लाइन स्टँडर्डनुसार वेगवेगळ्या प्राइमर प्रोबसह 10 डुप्लिकेट नमुने शोधले जाऊ शकतात.
परिमाणात्मक अभिकर्मक:
अचूकता
एका बॅचमधील अचूकता पूर्ण झाली पाहिजे: चाचणी एकाग्रतेच्या लॉगरिदमिक मूल्याच्या भिन्नतेचे गुणांक (CV,%) ≤5% आहे.जेव्हा नमुना एकाग्रता कमी असते, तेव्हा शोध एकाग्रतेच्या लॉगरिथमचे भिन्नतेचे गुणांक (CV,%) ≤10% असते
गुणात्मक अभिकर्मक:
अचूकता
एका बॅचमधील अचूकता पूर्ण केली पाहिजे:
(1) Ct मूल्याच्या भिन्नतेचे गुणांक (CV,%) ≤5%
समान नमुना 10 वेळा समांतर तपासला जातो आणि चाचणी परिणाम सुसंगत असावेत
पोस्ट वेळ: सप्टेंबर-18-2021
